[發(fā)明專利]表達(dá)非洲豬瘟病毒p34基因的重組腺病毒載體、重組腺病毒、方法及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010466094.7
• 申請(qǐng)日: 2020-05-28
• 公開（公告）號(hào): CN111549066A
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳平;張利娟;張婷婷;李娜;楊文清;沈亞釹;王書芳;李楠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 嘉銘（固安）生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/861
• 分類號(hào): C12N15/861;C12N15/34;C12N15/66;C12N7/01;A61K39/12;A61P31/20
• 代理公司: 杭州天昊專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 33283
• 代理人: 向慶寧

本發(fā)明公開了一種表達(dá)非洲豬瘟病毒p34基因的重組腺病毒載體、重組腺病毒、方法及應(yīng)用，其中，所述表達(dá)非洲豬瘟病毒p34基因的重組腺病毒載體包括腺病毒骨架載體和插入腺病毒骨架載體多克隆位點(diǎn)的非洲豬瘟病毒p34基因，所述p34基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述腺病毒骨架載體為pAd5；其中，所述重組腺病毒由本發(fā)明所公開的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞所獲得。本發(fā)明首次利用重組腺病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)非洲豬瘟病毒的p34蛋白，實(shí)現(xiàn)了p34蛋白的高水平表達(dá)，為非洲豬瘟病毒核酸疫苗的研制提供了病毒模型，為進(jìn)一步開發(fā)基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程和重組疫苗領(lǐng)域，具體涉及一種表達(dá)表達(dá)非洲豬瘟病毒p34基因的重組腺病毒載體、重組腺病毒、方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

非洲豬瘟(African Swine Fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African Swine FeverVirus,)引起豬的一種高感染性高致死率的急性、烈性傳染病。其臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、全身出血、呼吸障礙和神經(jīng)癥狀，發(fā)病率和死亡率極高，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害巨大。該病被列世界衛(wèi)生組織(OIE)列為A類疫病，受到世界各國(guó)的高度重視，我國(guó)已將此病規(guī)定為一類動(dòng)物傳染病，并作為動(dòng)物外來(lái)疫病進(jìn)行研究。目前尚無(wú)有效的疫苗用于該病的預(yù)防，主要通過(guò)發(fā)現(xiàn)后撲殺來(lái)控制其爆發(fā)和流行。

本病首次發(fā)現(xiàn)是在1914年?yáng)|非的坦桑尼亞共和國(guó)，1921年肯尼亞發(fā)生非洲豬瘟，隨后，南非和安哥拉也發(fā)生該病，之后多年，非洲豬瘟被認(rèn)為僅限于東非、中非和南非地區(qū)流行。近年來(lái)，非洲豬瘟已由非洲大陸橫跨到亞歐大陸的亞美尼亞、烏克蘭、俄羅斯，特別是高加勒地區(qū)疫情嚴(yán)峻，對(duì)我國(guó)造成極大威脅。2018年8月1日，遼寧省報(bào)告沈陽(yáng)市一養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)的豬陸續(xù)發(fā)生不明原因死亡，病死豬剖檢發(fā)現(xiàn)脾臟異常腫大，疑似非洲豬瘟病毒感染，國(guó)家外來(lái)動(dòng)物疫病研究中心采集病料進(jìn)行檢測(cè)，確診為非洲豬瘟病毒核酸陽(yáng)性，這是我國(guó)發(fā)現(xiàn)的首例非洲豬瘟。

ASFV是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，具有一個(gè)二十面體病毒外殼，直徑約175nm～215nm。由外包膜、病毒衣殼、內(nèi)包膜、核殼和病毒基因組5部分組成。病毒基因組是一條雙鏈DNA，DNA基因組長(zhǎng)度在170～193kb，編碼150～167個(gè)開放閱讀框(ORFs)，其中包括54個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和100多個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，具有23種不同的基因型。AFSV是第一個(gè)合成多蛋白作為基因表達(dá)策略的例子，非洲豬瘟病毒(ASFV)編碼一種名為P220的多聚蛋白，該P(yáng)220多聚蛋白存在于成熟病毒粒子的核衣殼中，占病毒蛋白總量的30％左右，在病毒組裝和病毒感染中發(fā)揮著重要的作用。P220多聚蛋白在蛋白酶的作用下可有序的裂解為P150、P34、P37和P14。p150、p34、p37和p14在病毒衣殼的組裝過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，其中，P34屬于P220中重要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，對(duì)病毒內(nèi)核蛋白的包裝起著重要的作用，具有較好的免疫原性，可以作為疫苗開發(fā)的抗原。

迄今為止，由于AFSV基因組的復(fù)雜性以及非洲豬瘟蛋白結(jié)構(gòu)的多樣性，一直尚未研發(fā)出十分有效的非洲豬瘟病毒疫苗，缺乏對(duì)非豬瘟病毒疫苗方法的開發(fā)研究。

發(fā)明內(nèi)容

基于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種表達(dá)非洲豬瘟病毒p34基因的重組腺病毒載體以及重組腺病毒，為ASFV的疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

腺病毒載體是目前應(yīng)用較為廣泛、研究較為深入的安全可靠的重組病毒表達(dá)載體，可用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效快速地表達(dá)目的蛋白。腺病毒的感染宿主范圍廣，可感染增殖細(xì)胞和非增殖細(xì)胞，具有較高的病毒滴度以及良好的生物安全性。因此利用腺病毒載體或腺病毒進(jìn)行p34基因的表達(dá)，對(duì)開發(fā)非洲豬瘟病毒疫苗具有重要意義。

作為本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種表達(dá)非洲豬瘟病毒p34基因的重組腺病毒載體。

作為優(yōu)選，重組腺病毒載體包括腺病毒骨架載體和插入腺病毒骨架載體多克隆位點(diǎn)的非洲豬瘟病毒p34基因，其中，所述p34基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。