[發(fā)明專利]一種TMAO生物陰性樣本、生物標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法及檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010465570.3
• 申請日: 2020-05-28
• 公開（公告）號: CN111693686B
• 公開（公告）日: 2021-09-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳露露;歐陽冬生;謝秀芬;李超鵬;侯利平;李曉暉
• 申請（專利權(quán)）人: 長沙都正生物科技股份有限公司
• 主分類號: G01N33/49
• 分類號: G01N33/49;G01N30/02;G01N30/06;G01N30/30;G01N30/32;G01N30/34;G01N30/72;G01N1/28;G01N1/38
• 代理公司: 長沙惟盛赟鼎知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 43228
• 代理人: 馬鳳蘭

本發(fā)明公開了一種TMAO生物陰性樣本、生物標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法及檢測方法，包括以下步驟：取生物樣本，加入生物酶作用于TMAO，從而降低或消除生物樣本中TMAO的含量，終止生物酶與TMAO間的反應(yīng)后得到所述生物陰性樣本。該方法利用生物酶制備TMAO生物陰性樣本，不僅能夠有效地消除內(nèi)源性TMAO背景干擾，而且反應(yīng)特異性強(qiáng)、效率高、操作方便且經(jīng)濟(jì)效益高，通過本發(fā)明方案能夠有效消除內(nèi)源性TMAO背景干擾，巧妙地利用酶反應(yīng)，將具備氧化性的TMAO還原、代謝分解或添加基團(tuán)改變結(jié)構(gòu)修飾，從而消除空白基質(zhì)中TMAO引起的背景干擾；后續(xù)通過對生物酶滅活或過濾等方式即可實現(xiàn)過量生物酶的去除，使得其還可進(jìn)一步應(yīng)用于TMAO標(biāo)準(zhǔn)品的制備中。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種TMAO生物陰性樣本、生物標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法及檢測方法。

背景技術(shù)

氧化三甲胺(Trimetlyl amine oxide，TMAO)，是膽堿或肉堿等生物堿成分經(jīng)腸道菌群代謝后生成的一種產(chǎn)物。相關(guān)研究表明，TMAO與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，如動脈粥樣硬化、心力衰竭和高血壓等。因此，對TMAO進(jìn)行檢測具有重要意義。在建立TMAO檢測方法時，需要用到人源血漿、尿液等作為空白基質(zhì)，然而，幾乎所有人血漿中均含有TMAO，因此，在方法學(xué)驗證時空白生物基質(zhì)的獲取成為了難點。傳統(tǒng)方法中通常采用水、牛血清白蛋白液、磷酸鹽緩沖液、人血清白蛋白等空白生物基質(zhì)。由于這些空白生物基質(zhì)與待測樣本基質(zhì)成分相差較遠(yuǎn)，導(dǎo)致其方法學(xué)驗證說服力不高，尤其是無法滿足藥典法規(guī)《生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則》中對于基質(zhì)效應(yīng)的闡釋要求，因而，得到的檢測結(jié)果可靠性不佳。

由于氧化甲胺具有氧化性，可被還原成三甲胺，因此，可利用其氧化還原性質(zhì)，加入特定的還原劑，將其還原為三甲胺或其他物質(zhì)，從而消除空白基質(zhì)中的TMAO背景干擾。部分研究表明可通過尋找低TMAO值樣本，然而，由于該類樣本數(shù)量有限且尋找過程較繁雜，因此，實用性不強(qiáng)。中國發(fā)明專利申請文件CN109387410A公開了一種TMAO陰性樣本及其制備方法與應(yīng)用，具體公開了通過在生物樣本中加入雷氏鹽以除去樣本中所含有的TMAO，該方法雖然能實現(xiàn)消除空白基質(zhì)中TMAO背景干擾的目的，采用化學(xué)絡(luò)合劑反應(yīng)存在明顯缺陷，如：1、反應(yīng)過程較為劇烈，反應(yīng)后將產(chǎn)生大量沉淀，而這些沉淀將會對樣本中其他成分造成影響；2、由于生物樣本中TMAO含量相對較低，加入的還原劑易過量，而過量的還原劑難以徹底去除或恰好反應(yīng)完全，導(dǎo)致得到的陰性樣本無法通過后期加入TMAO，制備成TMAO生物標(biāo)準(zhǔn)品；3、雷氏鹽還具有劇毒，極易入眼或粘附在皮膚上，產(chǎn)生強(qiáng)烈刺激；反應(yīng)過后的樣本對水體是極其有害，即使小量產(chǎn)品也不能接觸地下水，水道或污水系統(tǒng)，因此對實驗操作人員和環(huán)境都存在極大的安全隱患。

因此，開發(fā)一種高效、安全，既能消除內(nèi)源性TMAO背景干擾，又便于后處理的生物陰性樣本的制備方法具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明提出一種TMAO生物陰性樣本的制備方法，該方法制得的生物陰性樣本既能高效、安全的消除內(nèi)源性TMAO背景干擾，又便于后處理。

本發(fā)明還提出一種TMAO生物標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法。

本發(fā)明還提出一種TMAO檢測方法。

根據(jù)本發(fā)明的第一方面實施例的方法，包括以下步驟：

取生物樣本，加入生物酶作用于TMAO，從而降低或消除生物樣本中TMAO的含量，終止生物酶與TMAO間的反應(yīng)后得到所述生物陰性樣本。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述生物酶包括但不限于TMAO還原酶(trimethylamine-N-oxide reductase)、TMAO脫甲基酶(trimethylamine oxidedemethylase)、TMAO醛縮酶(trimethylamine oxide aldolase)、TMAO甲醛裂合酶(trimethylamine oxide formaldehyde lyase)中的至少一種。