[發明專利]一種檢測葉片病原真菌的染色方法

在審

• 申請號: 202010463836.0
• 申請日: 2020-05-27
• 公開（公告）號: CN111521472A
• 公開（公告）日: 2020-08-11
• 發明（設計）人: 王萌;梁曉宇;龍明騰;張宇
• 申請（專利權）人: 海南大學
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30;G01N1/28;G01N1/34;G01N1/31;G01N21/84
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 趙蕊紅

本發明公開了一種檢測葉片病原真菌的染色方法，包括前處理、固定脫色、抽濾染色和制片觀察。本發明的方法方便快捷、經濟實惠、綠色安全、效果好、適應性強，解決了目前常規的真菌染色研究中存在的染色層次不清、圖像模糊、操作時間過長等問題，實現病原菌快速高效染色，為真菌病害研究提供一種行之有效的染色方法，具有較強的實用價值和科研理論價值。

技術領域

本發明涉及真菌檢測技術領域，具體涉及一種檢測葉片病原真菌的染色方法。

背景技術

巴西橡膠樹(Hevea brasiliensis)栽培起源于亞馬孫河流域，后成功引進我國，成為國內天然橡膠的唯一來源，是我國一種重要的戰略資源。然而在橡膠生產過程中，病害一直是影響橡膠產量的重要制約因素。其中炭疽病一種由炭疽菌(Colletotrichum)引起的嚴重影響膠乳產量和品質的橡膠樹病害。

炭疽菌屬(Colletotrichum)真菌是一類重要的植物病原真菌，具有適生能力強、寄主多、地理分布廣等特點。炭疽菌是一種半活體營養寄生菌，在浸染寄主植物過程中往往形成特殊的浸染結構——附著孢，附著孢的形成對炭疽菌成功穿透寄主表皮形成寄生關系具有重要作用，炭疽菌能浸染橡膠樹嫩葉、葉柄、嫩梢等多個部位，可危害苗圃小苗、大田幼樹直至成齡開割膠樹，引起嫩葉脫落、嫩枝干枯等，導致開割延遲，造成重大產量損失。

橡膠樹炭疽病潛伏期長，不易被發現，在氣候條件適宜的情況下，極短的時間內即可爆發成災，預測難度大。病原真菌早期檢測技術有傳統定量法、酶聯免疫吸附法、分子檢測技術等，這些早期檢測技術特異性相對較差，靈敏度不高，容易受到植物因素干擾，且試劑耗材昂貴，操作繁瑣費時。

對于葉部真菌病害的組織病理學侵染過程的研究，傳統的研究方法有很多，在顯微鏡下觀察寄主組織中真菌結構是研究植物病原菌致病機制的重要方法。楊樹黑斑病、蘋果褐斑病、芒果炭疽病等許多典型的植物病原菌組織染色方法已有報道，但是，這些方法在橡膠樹葉片真菌病害研究中，有一定的局限性。在橡膠樹炭疽病的研究過程中，由于葉片自身含有較厚的蠟質層，通過傳統浸泡染色的方法，葉片浮于染色劑上方，染色劑不能滲入植物組織內部，對植物葉片內部真菌染色不夠清晰，無法完成預期結果，沒能解決實際科研問題。

常用的真菌染色方法有臺酚藍染色、蘇木素—伊紅染色、高碘酸－無色品紅染色、六胺銀染色、改良革蘭氏染色等，這些染色方法染色時間不易把控，容易過染，病原菌與葉片組織對比不明顯且切片固定等操作繁瑣。熒光染料Hoechst/Propidiumide雙熒光染色法，雖然能夠直接觀察病原菌在寄主組織中的位置，還能提供寄主細胞活力等信息，但熒光染色的高昂費用限制了其在田間病原菌檢測的大規模應用。另外，熒光染色劑存在熒光淬滅現象，熒光強度降低持續時間不長，植物的自發熒光也影響染色效果。

本發明能夠很好地彌補這些不足，且染色劑剛果紅無毒，具有方便快捷、經濟實惠、綠色安全、適應性強的特點，對橡膠樹炭疽病菌組織病理學進程的研究及流行病學預測預警具有重大意義。為該病害的有效防控提供科學依據，同時為其他葉部真菌病害的觀察奠定良好基礎，在其他經濟林木重要病害的早期檢測中具有廣闊的應用前景。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的缺點，提供一種方便快捷、經濟實惠、綠色安全、效果好、適應性強的檢測葉片病原真菌的染色方法，通過本發明中所述的染色方法能夠清楚地觀察到葉片內部的真菌結構，解決了目前常規的真菌染色研究中存在的染色層次不清、圖像模糊、操作時間過長等問題，實現病原菌快速高效染色，為真菌病害研究提供一種行之有效的染色方法，具有較強的實用價值和科研理論價值。

本發明的目的通過以下技術方案來實現：一種檢測葉片病原真菌的染色方法，它包括以下步驟：

S1.前處理：選擇被病原真菌侵染的葉片作為處理材料，剪成塊狀；

S2.固定脫色：將塊狀樣品浸泡在脫色液中進行脫色，所述脫色液為三氯乙酸、乙醇與氯仿的混合溶液，脫色時間為10～15h；