[發明專利]一種豬流行性腹瀉病毒重組疫苗株及其制備方法

在審

• 申請號: 202010462857.0
• 申請日: 2020-05-27
• 公開（公告）號: CN111607572A
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發明（設計）人: 陳冰清;李震;董世娟;于瑞嵩;司伏生;謝春芳
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/50;C12N15/63;C12R1/93
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 劉妮

本發明公開了一種豬流行性腹瀉病毒重組疫苗株及其制備方法，該豬流行性腹瀉病毒重組疫苗株是以PED經典毒株DR13為骨架，將抗原基因S基因替換成PED流行毒株S基因。其中PED流行毒株S基因來源于美國流行毒株KF650375。該重組疫苗株毒株生長特性良好，已傳至60余代，遺傳穩定性好，病毒滴度達10⁷TCID50。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種豬流行性腹瀉病毒重組疫苗株及其制備方法。

背景技術

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的一種接觸性腸道傳染病，其特征為嘔吐、腹瀉、脫水，死亡率很高，尤其是未斷奶仔豬。2010年以來，因PED的大范圍流行，我國養豬業遭受了重大經濟損失，甚至威脅到了國家肉食品安全供應。2013年3月以后，PED首次在美國報道，并迅速蔓延至其他美洲、歐洲國家；亞洲其他國家也相繼報道PED疫情的暴發。目前，PED已蔓延至全球，給全世界養豬業的疾病防控帶來了嚴峻的挑戰。該病近些年來呈現了新的流行特征，表現為死亡率極高(90-100％)、患病仔豬日齡更低、疫苗防控效果很差，這些現象與長期免疫壓力下的PEDV基因變異導致免疫原性及毒力改變有關，因此急需研制針對新流行毒株的新一代PEDV疫苗。

近年來，國內外的研究者在PED疫苗方面已經做了大量的研究工作，但到目前為止，還沒有研制出特別有效的PED疫苗用以控制PED的發生。韓國、日本等國家廣泛使用的PED疫苗是傳統的活苗和滅活苗，所有的滅活苗和傳代致弱的減毒疫苗都能減少死亡率，但不能顯著地減少發病率和病毒載量。2014年，美國批準兩個疫苗上市，分別是RNA疫苗和滅活的全病毒疫苗，美國豬場使用這兩種疫苗，均能減少豬的死亡率，然而缺乏臨床使用的免疫相關性和免疫效率數據的相關報道。加拿大、歐洲商品化的PED疫苗主要是基于滅活的病毒與佐劑組成的滅活疫苗。國內市場已經商品化的PED疫苗都是聯苗，主要是豬傳染性胃腸炎(TGEV)與PEDV的二聯滅活苗或者二聯弱毒苗，目前已經有8個PED疫苗獲得了新獸藥證書，涉及的PED疫苗毒株有7個，分別為CV777株及其致弱毒株CV777，AJ1102株及其致弱毒株AJ1102-R，弱毒株ZJ08株，SCSZ株和LW/L株。近年來，隨著PED疫情的流行，以CV777毒株為代表的經典毒株生產的疫苗起不到有效的保護，造成免疫失敗的現象屢屢發生。流行毒株產生的疫苗針對性強，但免疫效果也良莠不齊。

發明內容

針對現有PEDV商品化疫苗保護效力在逐年降低問題，本發明提供了一種以PED經典毒株DR13為骨架的重組疫苗株，該重組疫苗株具有流行毒株的免疫原性，能有效地保護新生仔豬。

為了實現上述技術目的，本發明具體通過以下技術方案實現：

一種豬流行性腹瀉病毒重組疫苗株，是以PED經典毒株DR13為骨架，將抗原基因S基因替換成PED流行毒株S基因。

所述的PED流行毒株S基因來源于美國流行毒株KF650375。

根據NCBI中KF650375的S基因的序列，設計并合成引物SEQ ID NO.19～102，其中S-1(1-623bp)以pJET1.2/blunt.Q4(實驗室保存質粒含KF294254 S基因1-1366bp)為模板，PED232 PED233為引物，擴增S-1片段，S-6(2654-3183bp)以pJET1.2/blunt.Q2(KF294254 S基因2845-3731bp)為模板，PED234 PED235為引物擴增S-6片段。其余片段通過引物長度59bp，相鄰引物間重疊21bp，通過引物小片段PCR融合，從一級片段逐級放大至四級片段，合成出PED流行毒株S基因。

在本發明的另一方面，提供了上述重組疫苗株的制備方法，包括以下步驟：

1)以PED經典毒株DR13基因為模板，設計引物對B；