[發(fā)明專利]一種苜蓿花葉病毒的侵染性克隆、重組農(nóng)桿菌及構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010461785.8
• 申請(qǐng)日: 2020-05-27
• 公開（公告）號(hào): CN111705075B
• 公開（公告）日: 2022-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 程曉非;武曉云;車欣洋;劉佳慧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;C12N15/40;C12N1/21;C12N15/81;C12R1/01
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 王志新

一種苜蓿花葉病毒的侵染性克隆、重組農(nóng)桿菌及構(gòu)建方法，屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。為了提高侵染性克隆侵染效率，本發(fā)明提供了一種苜蓿花葉病毒的侵染性克隆，所述侵染性克隆載體由苜蓿花葉病毒全基因組與含有CaMV 35S啟動(dòng)子和HDV核酶Rz的植物表達(dá)載體pCB301?2μ?HDV重組后獲得的。所述侵染性克隆由下述三個(gè)載體組成：攜帶苜蓿花葉病毒基因組RNA1的重組載體pCB301?AMVRNA1、攜帶苜蓿花葉病毒基因組RNA2的重組載體pCB301?AMVRNA2和攜帶苜蓿花葉病毒基因組RNA3的重組載體pCB301?AMVRNA3。本發(fā)明能夠節(jié)省病毒侵染時(shí)間，提高的侵染的成功率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種苜蓿花葉病毒的侵染性克隆、重組農(nóng)桿菌及構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

植物病毒侵染性克隆是植物病毒學(xué)研究領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究工具。克隆后的病毒基因組易于進(jìn)行突變、重組等分子操作，在植物病毒的基因功能，侵染機(jī)制，植物抗病毒機(jī)制等方面具有重要的作用。此外，植物病毒的侵染性克隆也可作為基因表達(dá)或沉默的載體，進(jìn)行植物基因功能的研究，或者進(jìn)行外源蛋白的表達(dá)。目前有許多植物病毒的侵染性克隆被構(gòu)建，例如：燕飛，鄭紅英，肖彩利，韓科雷，魯宇文，林林，陳劍平，黃瓜綠斑駁花葉病毒的侵染性克隆載體和農(nóng)桿菌菌株及其制備方法和應(yīng)用(CN104498521A)；宋震，崔甜甜，賓羽，晏建紅，李中安，周常勇，三元穿梭載體及利用其構(gòu)建CLBV侵染性克隆的方法(CN108559759A)；余乃通，劉志昕，劉鋒，瞿玲，笈小龍，鄭賢欣，一種香蕉束頂病毒侵染性克隆及構(gòu)建方法(CN107488673A)；田延平，王健，李向東，耿超，馬鈴薯卷葉病毒侵染性克隆及其構(gòu)建方法(CN109797162A)，等。

苜蓿花葉病毒(Alfalfa mosaic virus，AMV)屬于雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)苜蓿花葉病毒屬(Alfamovirus)，是該屬的代表種。該病毒寄主范圍廣，能侵染51個(gè)科的430種雙子葉植物，常見的包括苜蓿、三葉草、馬鈴薯、菜豆、豇豆、赤豆、大豆、綠豆、豌豆、蠶豆、菜豆、煙草、辣椒等。該病毒通過20多種蚜蟲以非持久方式進(jìn)行傳播，也可通過汁液摩擦、嫁接和種子傳播；其中，帶毒種子是遠(yuǎn)距離傳播的主要途徑。該病毒主要引起植物葉片黃化或花葉、偶見皺縮和植株矮化的癥狀，侵染后可嚴(yán)重影響作物的光合作用，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。AMV的基因組是3條正義單鏈RNA(positive-sense，single-strandedRNA，ssRNA)，分別命名為RNA1、RNA2和RNA3。RNA1、RNA2和RNA3的5′端都含有甲基化的帽子(m7G5′ppp5′Gp)，但3′端沒有細(xì)胞信使RNA(mRNA)類似的多聚腺苷酸尾巴(poly-A)，而存在一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)類似的結(jié)構(gòu)。RNA1和RNA2含有一個(gè)開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，分別編碼約126kDa的1a蛋白和約90kDa的2a蛋白；1a蛋白和2a蛋白組成病毒的RNA依賴性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)，參與病毒基因組的復(fù)制以及亞基因組的轉(zhuǎn)錄。RNA3含有2個(gè)ORF，分別編碼約32kDa的運(yùn)動(dòng)蛋白(Movement protein，MP)和約24kDa的外殼蛋白(Coat protein，CP)。MP通過RNA3直接翻譯，而CP通過亞基因組RNA4表達(dá)。該病毒的侵染性克隆沒有相關(guān)專利，但是已有文獻(xiàn)報(bào)道：Sanchez-Navarro J,Miglino R,Ragozzino A,Bol JF.Engineering of Alfalfa mosaic virus RNA3 into anexpression vector,Archives of Virology,2001,146:923-939；Volt AC,Neeleman L,Linthorst HJM,Bol JF.Role of the3′-Untranslated Regions of Alfalfa MosaicVirus RNAs in the Formation of a Transiently Expressed Replicase in Plantsand in the Assembly of Virions,Journal of Virology,2001,75:6440-6449.其中，Sanchez-Navarro等人構(gòu)建的苜蓿花葉病毒侵染性克隆將該病毒的RNA1、RNA2和RNA3分別插入到原核生物T7啟動(dòng)子下游，通過體外轉(zhuǎn)錄的方法獲得病毒的基因組RNA，再通過機(jī)械摩擦接種植物或者PEG法轉(zhuǎn)染植物原生質(zhì)體，而Volt等人構(gòu)建的苜蓿花葉病毒侵染性克隆將該病毒的RNA1、RNA2和RNA3分別插入到植物雙元表達(dá)載體的花椰菜花葉病毒(Cauliflowermosaic virus，CaMV)的35S啟動(dòng)子和胭脂氨酸合成酶(NOS)的終止子之間，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染植物。