[發(fā)明專利]一種苜蓿花葉病毒的侵染性克隆、重組農(nóng)桿菌及構(gòu)建方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 202010461785.8 | 申請日： | 2020-05-27 |
| 公開（公告）號： | CN111705075B | 公開（公告）日： | 2022-01-11 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 程曉非;武曉云;車欣洋;劉佳慧 | 申請（專利權(quán)）人： | 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) |
| 主分類號： | C12N15/82 | 分類號： | C12N15/82;C12N15/40;C12N1/21;C12N15/81;C12R1/01 |
| 代理公司： | 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211 | 代理人： | 王志新 |
| 地址： | 150030 黑龍*** | 國省代碼： | 黑龍江;23 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 苜蓿 花葉 病毒 侵染 克隆 重組 桿菌 構(gòu)建 方法 | ||
1.一種侵染性克隆的侵染性重組農(nóng)桿菌，其特征在于，所述侵染性重組農(nóng)桿菌是將重組酵母質(zhì)粒pCB301-AMVRNA1、重組酵母質(zhì)粒pCB301-AMVRNA2和重組酵母質(zhì)粒pCB301-AMVRNA3分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)篩選分別獲得含有pCB301-AMVRNA1的重組農(nóng)桿菌、含有pCB301-AMVRNA2的重組農(nóng)桿菌和含有pCB301-AMVRNA3的重組農(nóng)桿菌，上述3種重組農(nóng)桿菌的組合即為侵染性重組農(nóng)桿菌；
所述重組酵母質(zhì)粒pCB301-AMVRNA1、重組酵母質(zhì)粒pCB301-AMVRNA2和重組酵母質(zhì)粒pCB301-AMVRNA3的制備方法如下：（1）提取含有苜蓿花葉病毒的大豆葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到苜蓿花葉病毒的cDNA；以所述cDNA為模板，通過PCR方法分段擴(kuò)增，分別獲得苜蓿花葉病毒基因組的RNA1、RNA2和RNA3；所述RNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述RNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述RNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
（2）將植物表達(dá)載體pCB301-2μ-HDV線性化處理，得到線性化pCB301-2μ-HDV載體；
（3）同源重組：將所述線性化pCB301-2μ-HDV載體分別與步驟（1）獲得的RNA1、RNA2和RNA3等摩爾比例混合，轉(zhuǎn)化酵母菌得到重組酵母菌，篩選后提取質(zhì)粒，分別獲得含有RNA1的重組酵母質(zhì)粒pCB301-AMVRNA1、含有RNA2 的重組酵母質(zhì)粒pCB301-AMVRNA2和含有RNA3的重組酵母質(zhì)粒pCB301-AMVRNA3；質(zhì)粒pCB301-AMVRNA1、質(zhì)粒pCB301-AMVRNA2和質(zhì)粒pCB301-AMVRNA3的組合即為苜蓿花葉病毒侵染性克隆。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的侵染性重組農(nóng)桿菌，其特征在于，步驟（1）中所述反轉(zhuǎn)錄所用的引物為AMV-Rz-R，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的侵染性重組農(nóng)桿菌，其特征在于，步驟（1）中RNA1的 PCR擴(kuò)增引物為AMV-R1-35SF和AMV-Rz-R；RNA2的 PCR擴(kuò)增引物為AMV-R2-35SF和AMV-Rz-R；RNA3的PCR擴(kuò)增引物為AMV-R3-35SF和AMV-Rz-R；所述AMV-Rz-R核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述AMV-R1-35SF核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述AMV-R2-35SF核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示；所述AMV-R3-35SF核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的侵染性重組農(nóng)桿菌，其特征在于，步驟（2）所述的植物表達(dá)載體pCB301-2μ-HDV線性化處理的方法為：以pCB301-2μ-HDV為模板，使用引物pCB301-RZ-F和pCB301-35S-R引物擴(kuò)增pCB301-2μ-HDV載體，得到pCB301-2μ-HDV線性化的載體；所述引物pCB301-RZ-F核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述引物pCB301-35S-R核苷酸序列如SEQ IDNO：9所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的侵染性重組農(nóng)桿菌，其特征在于，步驟（3）中所述酵母菌為酵母菌Y2H Gold。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的侵染性重組農(nóng)桿菌，其特征在于，所述農(nóng)桿菌為農(nóng)桿菌GV3101。
該專利技術(shù)資料僅供研究查看技術(shù)是否侵權(quán)等信息，商用須獲得專利權(quán)人授權(quán)。該專利全部權(quán)利屬于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，未經(jīng)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)許可，擅自商用是侵權(quán)行為。如果您想購買此專利、獲得商業(yè)授權(quán)和技術(shù)合作，請聯(lián)系【客服】
本文鏈接：http://www.szxzyx.cn/pat/books/202010461785.8/1.html，轉(zhuǎn)載請聲明來源鉆瓜專利網(wǎng)。
- 一種農(nóng)桿菌侵染玉米幼胚的方法
- 表面活性劑與超聲波協(xié)同提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法及其應(yīng)用
- 黃瓜綠斑駁花葉病毒的侵染性克隆載體和農(nóng)桿菌菌株及其制備方法和應(yīng)用
- 一種利用農(nóng)桿菌侵染玉米幼胚的遺傳轉(zhuǎn)化方法
- 一種紅外熱像儀監(jiān)測香蕉枯萎病的技術(shù)方法及應(yīng)用
- 一種改良的叢枝菌根侵染程度檢測方法
- 一種植物花序侵染裝置
- 可侵染煙草的大豆花葉病毒侵染性克隆載體和農(nóng)桿菌菌株及其應(yīng)用
- 一種紡織用侵染裝置
- 一種高侵染力冬蟲夏草菌株的培養(yǎng)方法及其應(yīng)用
