[發(fā)明專利]基于基因條形碼及高分辨熔解曲線分析區(qū)分動物源性成分的試劑盒及檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010461048.8
• 申請日: 2020-05-27
• 公開（公告）號: CN111549145A
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐秦峰;賀曉玲;提拉古麗·排爾哈提;翟露;王增麗
• 申請（專利權(quán)）人: 陜西科技大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6858
• 代理公司: 西安新思維專利商標事務(wù)所有限公司 61114
• 代理人: 李罡

本發(fā)明公開了一種基于基因條形碼及高分辨熔解曲線分析區(qū)分動物源性成分的試劑盒及檢測方法。本發(fā)明的技術(shù)方案為：檢測方法主要步驟為：1.選取公開的微型基因條形碼序列為引物，以提取自待測樣品中的DNA為模板進行PCR擴增；2.對PCR擴增產(chǎn)物直接進行高分辨熔解；3.采用MyGo Pro儀器分析采集的數(shù)據(jù)，利用分析歸一化、差異化熔解曲線以及PCA中的一種或多種進行目的基因的區(qū)分與鑒別。本發(fā)明實現(xiàn)了對樣品中不同動物源性成分的鑒別。解決了特異性引物設(shè)計和優(yōu)化困難，通用性引物通用范圍小的不足，提高了檢測通量和降低了操作難度。大大提高了檢測通量，重復(fù)性良好，檢測效果理想。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于基因條形碼及高分辨熔解曲線分析區(qū)分動物源性成分的試劑盒及檢測方法。

背景技術(shù)

DNA條形碼是一段較短的標準DNA序列，是物種的一種身份識別系統(tǒng)。自2003年加拿大科研人員Hebert等人提出用線粒體細胞色素c氧化酶（COI）作為DNA條形碼來進行識別物種身份后，關(guān)于DNA條形碼的分析和研究開始發(fā)展和擴大。DNA條形碼的識別主要依據(jù)物種的種內(nèi)保守性和種間多樣性。由于DNA條形碼不受形態(tài)學(xué)方法限定，操作簡單，近年來在動物，植物，微生物方面取得了廣泛應(yīng)用。經(jīng)過篩選和研究分析，植物條形碼多采用rbcL和matK區(qū)域序列，動物條形碼一般為線粒體細胞色素c氧化酶（COI）。在分析深加工產(chǎn)品和短片段的目標基因時，長片段的DNA條形碼（~650bp）應(yīng)用受到限制。本發(fā)明采用的微型基因條碼大小為192bp，更適合各種原材料及其加工產(chǎn)品的分析，同時具有更高的分辨率。在實際應(yīng)用中基因條形碼需要結(jié)合PCR以及測序來完成，通過PCR富集和篩選靶目標，測序獲得PCR擴增產(chǎn)物的序列信息，經(jīng)過在線數(shù)據(jù)庫（BOLD/NCBI）的分析比對，最終確定分析對象的身份信息。但由于測序價格高且耗時長，使得條形碼方法無法得到廣泛應(yīng)用。本發(fā)明提出HRM分析結(jié)合DNA條形碼的檢測方法。

HRM是一種實時PCR結(jié)合飽和染料和高分辨率儀器來檢測樣本熒光信號的方法，通過分析采集的熒光信息和熔解曲線，來進行基因篩選和分型。對于70-300bp的基因序列，HRM可以實現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性，短序列的插入和缺失的檢測，具有很高的靈敏度。相比較于普通熔解曲線而言，熔解曲線形狀和位置重復(fù)性好，檢測結(jié)果更加準確。DNA條形碼結(jié)合HRM可以實現(xiàn)閉管檢測和鑒定多個目標序列，具有操作簡單，檢測范圍廣，檢測速度快，靈敏度高，高通量的優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是要提供一種基于基因條形碼及高分辨熔解曲線分析區(qū)分動物源性成分的試劑盒及檢測方法，為微型基因條碼結(jié)合HRM在摻假鑒定方面提供了方向和參考數(shù)據(jù)，包括PCR反應(yīng)體系參數(shù)，擴增程序和高分辨熔解程序，在發(fā)展真實性鑒定和原產(chǎn)地溯源領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種基于基因條形碼及高分辨熔解曲線分析區(qū)分動物源性成分的檢測方法，具體包括以下步驟：

（1）根據(jù)樣品中的不同動物源性成分的可能存在情況，確定需要鑒別的各動物源性成分所對應(yīng)的動物種類，根據(jù)確定的動物種類，在NCBI查找微型基因條形碼對應(yīng)的DNA序列，使用u-Melt軟件在線擬合高分辨熔解曲線，判斷是否可以達到區(qū)分目的，若可能存在的動物源性成分種類在GB/T 35918-2018所列的微型基因條形碼可區(qū)分的范圍內(nèi)，則擴增片段長度為192bp；

（2）利用微型基因條形碼進行PCR擴增并使用高分辨熔解程序熔解可能存在的動物源性成分對應(yīng)的標準品DNA，制定高分辨熔解數(shù)據(jù)庫；

（3）利用微型基因條形碼進行PCR擴增并使用高分辨熔解程序熔解實際樣品中的DNA，將其放入步驟（2）所得的標準高分辨熔解數(shù)據(jù)庫中分析比對，區(qū)分和鑒別樣品中動物源性成分。

所述步驟（2）中，用于擴增的引物序列為：

上游引物：