[發明專利]基于基因條形碼及高分辨熔解曲線分析區分動物源性成分的試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202010461048.8
• 申請日: 2020-05-27
• 公開（公告）號: CN111549145A
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發明（設計）人: 徐秦峰;賀曉玲;提拉古麗·排爾哈提;翟露;王增麗
• 申請（專利權）人: 陜西科技大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6858
• 代理公司: 西安新思維專利商標事務所有限公司 61114
• 代理人: 李罡

1.一種基于基因條形碼及高分辨熔解曲線分析區分動物源性成分的檢測方法，其特征在于：

具體包括以下步驟：

（1）根據樣品中的不同動物源性成分的可能存在情況，確定需要鑒別的各動物源性成分所對應的動物種類，根據確定的動物種類，在NCBI查找微型基因條形碼對應的DNA序列，使用u-Melt軟件在線擬合高分辨熔解曲線，判斷是否可以達到區分目的，若可能存在的動物源性成分種類在GB/T 35918-2018所列的微型基因條形碼可區分的范圍內，則擴增片段長度為192bp；

（2）利用微型基因條形碼進行PCR擴增并使用高分辨熔解程序熔解可能存在的動物源性成分對應的標準品DNA，制定高分辨熔解數據庫；

（3）利用微型基因條形碼進行PCR擴增并使用高分辨熔解程序熔解實際樣品中的DNA，將其放入步驟（2）所得的標準高分辨熔解數據庫中分析比對，區分和鑒別樣品中動物源性成分。

2.根據權利要求1所述的一種基于基因條形碼及高分辨熔解曲線分析區分動物源性成分的檢測方法，其特征在于：

所述步驟（2）中，用于擴增的引物序列為：

上游引物：

FISHCOILBC_ts：5'-CTCAACYAATCAYAAAGATATYGGCAC-3'；

下游引物:

REVshort1：5'-GGYATNACTATRAAGAAAATTATTAC-3'。

3.根據權利要求1或2所述的一種基于基因條形碼及高分辨熔解曲線分析區分動物源性成分的檢測方法，其特征在于：

所述PCR擴增體系為：5.00μL 2×Tap PCR Master Mix，1.00μL（20ng/μL） DNA模板，10μM的正向引物和反向引物各0.20μL，0.50μL 20×EvaGreen染料，最后用超純水將反應體系補足至10.00μL；

所述PCR擴增程序為：94℃預變性5min；執行40個循環，包括94℃變性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s；72℃再延伸5min。

4.根據權利要求3所述的一種基于基因條形碼及高分辨熔解曲線分析區分動物源性成分的檢測方法，其特征在于：

所述高分辨熔解程序為：初始溫度65℃停留60s，熔解梯度為4℃/s，終止溫度95℃停留1s，熔解梯度為0.05℃/s。

5.一種基于基因條形碼及高分辨熔解曲線分析區分動物源性成分的試劑盒，其特征在于：

包括微型基因條形碼引物、PCR反應試劑、熒光染料、雙蒸水以及對照品的PCR擴增產物對應的高分辨熔解曲線，所述對照品選自不同動物種類的基因組DNA或對應各動物種類的基因組DNA的組合。

6.根據權利要求5所述的一種基于基因條形碼及高分辨熔解曲線分析區分動物源性成分的試劑盒，其特征在于：

所述不同動物種類的基因組DNA 為山羊、綿羊、牛和水牛的基因組DNA。