[發明專利]一種合成單葡萄糖甘油二酯的突變體酶及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202010460058.X
• 申請日: 2020-05-27
• 公開（公告）號: CN111518784B
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發明（設計）人: 魏濤;張志平;楊旭;趙彩夢;趙雨哲;黃申;毛多斌;段乃心;王敏;孟祥玉
• 申請（專利權）人: 鄭州輕工業大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C12P19/18;C12P19/02
• 代理公司: 鄭州優盾知識產權代理有限公司 41125
• 代理人: 冉珊敏

1.一種合成單葡萄糖甘油二酯的突變體酶，其特征在于：所述突變體的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.權利要求1所述的突變體酶在高轉化率合成單葡萄糖甘油二酯中的應用，其特征在于，將1 mL突變體甘油糖脂合成酶的酶活標準反應體系：0.1 mM UDP-葡萄糖、0.1 mM甘油二酯、2.0 μM純化蛋白和50 mM pH 8.5的Tris-HCl反應緩存液，反應溫度35℃、200 rpm恒定震蕩孵育20小時。

3.權利要求1所述的合成單葡萄糖甘油二酯的突變體酶的制備方法，其特征在于，步驟如下：

（1）海洋細菌C. pelagibacter sp. HTCC7211培養，培養體積為1 L；

（2）重組質粒的構建：以從步驟（1）培養的海洋細菌C. pelagibacter sp. HTCC7211中提取基因組DNA，利用上游引物Ⅰ、下游引物Ⅰ進行PCR擴增甘油糖脂合成酶Agt的基因，經酶切回收后連接到pET15b中，得pET15b/Agt重組質粒，經轉化、提取pET15b/Agt質粒并進行雙酶切；

（3）突變體重組質粒的克隆：以pET15b/Agt重組質粒為模板，以上游引物Ⅱ、下游引物Ⅱ為引物進行重疊延伸PCR，將突變體的全長基因克隆到pET15b載體上，得突變體重組質粒；

（4）突變體的純化：步驟（3）中測序正確的突變體重組質粒經轉化、誘導、純化得突變體。

4.根據權利要求3所述的合成單葡萄糖甘油二酯的突變體酶的制備方法，其特征在于：所述步驟（2）中上游引物Ⅰ序列如SEQ ID No.3所示、下游引物Ⅰ序列如SEQ ID No.4所示。

5.根據權利要求3所述的合成單葡萄糖甘油二酯的突變體酶的制備方法，其特征在于：所述步驟（3）中上游引物Ⅱ序列如SEQ ID No.5所示、下游引物Ⅱ序列如SEQ ID No.6所示。