[發明專利]一種合成單葡萄糖甘油二酯的突變體酶及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202010460058.X
• 申請日: 2020-05-27
• 公開（公告）號: CN111518784B
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發明（設計）人: 魏濤;張志平;楊旭;趙彩夢;趙雨哲;黃申;毛多斌;段乃心;王敏;孟祥玉
• 申請（專利權）人: 鄭州輕工業大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C12P19/18;C12P19/02
• 代理公司: 鄭州優盾知識產權代理有限公司 41125
• 代理人: 冉珊敏

本發明屬于生物工程領域，特別是指一種合成單葡萄糖甘油二酯的突變體酶及其制備方法和應用。所述突變體的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、核苷酸所編輯的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本申請制備的海洋細菌甘油糖脂合成酶突變體T257S具有良好的轉糖基催化活性，可以高效轉化UDP?葡萄糖和甘油二酯（sn?甘油?1?硬脂酸酯?2?油酸酯），單葡萄糖甘油二酯轉化率達到68.5%，制備的單葡萄糖甘油二酯純度高，純度達到93.8%以上，適用于糖脂化合物單葡萄糖甘油二酯生物酶法制備，具有較好的工業應用前景。

技術領域

本發明屬于生物工程領域，特別是指一種合成單葡萄糖甘油二酯的突變體酶及其制備方法和應用。

背景技術

甘油糖脂是糖以糖苷鍵與甘油脂鏈接的化合物，主要存在于海藻、藍細菌和高等植物中。甘油糖脂的基本結構由一個1，2-二酰基-sn-甘油部分構成，其單糖或寡糖附著在甘油主鏈的sn-3位置，主要包括單半乳糖甘油二酯(monogalactosyl diacylcerol，MGal-DAG)、單葡萄糖甘油二酯(monoglucosyl diacylcerol，MGlc-DAG)、、單半乳糖甘油一酯(monogalactosyl monoacylglycerol，MGMG) 、雙半乳糖甘油二酯(digalactosyldiacylglycerol，DGDG)和硫代異鼠李糖甘油二酯(sulfoquinovosy ldiacylglycerol，SQDG)等。 甘油糖脂具有重要的生物活性，比如抗腫瘤、抗病毒和抗炎活性等，相關研究已經引起人們的廣泛關注。

目前獲得甘油糖脂方法主要從植物組織中直接提取和化學合成。常見提取方法是液-液萃取法（有機溶劑為氯仿/甲醇(2∶1，v/v)），該方法所提取的脂質中不僅含有甘油糖脂，還含中性脂、游離脂肪酸和磷脂，需要進一步采用薄層色譜法/固相萃取/高效液相色譜法等來分離純化，該方法存在甘油糖脂在植物資源中含量少、收率（不超過20%）和產量較低等問題（The Journal of Biological Chemistry, 1957, 226:497-509；Journal ofLipid Research, 2006, 47:804-814.）；化學方法合成甘油糖脂存在副反應發生、合成步驟較多和合成反應效率較低等問題(Chinese Journal of Chemistry, 2009, 27: 2217-2222；李春霞，甘油糖脂的合成及構效關系的初步研究[D]，青島海洋大學，2002)。

鑒于目前甘油糖脂制備方法的不足，提出一種利用生物酶法制備甘油糖脂化合物單葡萄糖甘油二酯方法。

發明內容

本發明提出一種合成單葡萄糖甘油二酯的突變體酶及其制備方法和應用，提高了單葡萄糖甘油二酯的合成效率和產物純度。

本發明的技術方案是這樣實現的：

一種合成單葡萄糖甘油二酯的突變體酶，所述突變體的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示、核苷酸所編輯的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

上述的突變體酶在高轉化率合成單葡萄糖甘油二酯中的應用，將1 mL突變體甘油糖脂合成酶的酶活標準反應體系：0.1 mM UDP-葡萄糖、0.1 mM甘油二酯、2.0 μM純化蛋白和50 mM pH 8.5的Tris-HCl反應緩存液，反應溫度35℃、200 rpm恒定震蕩孵育20小時。

上述的合成單葡萄糖甘油二酯的突變體酶的制備方法，步驟如下：

（1）海洋細菌C. pelagibacter sp. HTCC7211培養，培養體積為1 L；