[發明專利]體外誘導類角膜緣干細胞的方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202010459246.0
• 申請日: 2020-05-27
• 公開（公告）號: CN113736735A
• 公開（公告）日: 2021-12-03
• 發明（設計）人: 孫長斌;張曦
• 申請（專利權）人: 深圳華大生命科學研究院
• 主分類號: C12N5/0797
• 分類號: C12N5/0797;C12N5/079
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 肖陽

本發明提供了一種體外誘導類角膜緣干細胞的方法及試劑盒。所提供的方法包括(1)利用第一誘導劑對多能干細胞進行第一培養，獲得表面外胚層細胞，第一誘導劑包括第一小分子抑制劑和第一蛋白，第一小分子抑制劑包括TGF?beta/Smad抑制劑，第一蛋白包括bFGF或BMP4；(2)利用第二誘導劑對表面外胚層細胞進行第二培養，以便獲得類角膜緣干細胞，第二誘導劑包括第二蛋白，第二蛋白包括BMP4。所提供的試劑盒包括小分子抑制劑、蛋白和培養基，小分子抑制劑包括SB505124或SB431542；蛋白包括bFGF或BMP4。利用該方法或試劑盒能夠快速獲得類角膜緣干細胞，而且穩定性好。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種體外誘導類角膜緣干細胞的方法及試劑盒。

背景技術

角膜緣干細胞位于角膜和鞏膜交接處的角膜緣組織，具有很強的增殖能力，能夠有效地進行角膜再生和修復。全球視力障礙患者估計有4億多人，其中4千多萬人失明。在這些人當中因為角膜(cornea)功能紊亂造成的失明人數大概有1千多萬，每年新增1百多萬新的失明患者。此外，由于遺傳、化學、燒傷、感染等原因會導致角膜緣功能不能正常行使，造成角膜緣干細胞缺乏癥(limbal stem cells deficiency，LSCD)的發生，使正常角膜上皮穩態遭到破壞，是造成視力低下、失明的重要原因之一。目前，LSCD的治療方式有自體或異體角膜緣移植、體外培養的LSCs移植、體外培養的口腔黏膜細胞等移植、自體或異體結膜移植等。角膜緣移植雖然具有一定療效，但是供體材料匱乏，慢性炎癥和免疫排斥反應常常影響手術的成功率，自體角膜緣組織的獲取也存在角膜脫落、感染等風險。并且對于雙側LSCD患者來說，更是無法獲取自體的角膜緣組織。

角膜發育自表面外胚層，小分子化合物可以通過調節細胞外的信號通路從而模擬發育過程，誘導多能干細胞向表面外胚層的發育，進一步形成角膜緣干細胞。2014，Mikhailova等人開發了角膜緣干細胞小分子誘導技術，利用小分子抑制劑抑制TGF-b和Wnt信號通路，模擬角膜的早期發育階段。獲得細胞表達典型的角膜標記，能夠分成兩個清晰的層，只有在頂層表達K12基因。該研究首次描述了小分子物質在無血清、無滋養層條件下進行LSC的有效誘導。近期，該研究團隊報道了該方法的改進技術，進一步利用無動物源、無血清的方法進行LSC的誘導。利用小分子化合物誘導多能干細胞分化為LSC，有利于誘導技術的穩定，同時不添加血清和飼養層細胞，提高了安全性，必將成為多能干細胞體外誘導技術研究的主要方向。盡管利用小分子物質進行誘導的方法有了一定的進展，但目前報道的不多，如何利用小分子化合物在體外獲得角膜緣干細胞，用于角膜的再生和修復，還需要進一步改進。

發明內容

本發明至少在一定程度上解決現有技術中的技術問題至少之一。為此，本發明提供了一種能夠在體外穩定獲得類角膜緣干細胞的方法以及試劑盒。

多能干細胞(pluripotent stem cell,PSC)具有多能性和無限擴增能力，能夠在體外誘導形成角膜緣干細胞。近年來雖然有多能干細胞向角膜緣干細胞的誘導方法，但是多能干細胞在體外誘導形成角膜緣干細胞時，仍然面臨著諸多挑戰。例如，誘導方法中涉及需要滋養層細胞、成分不明確的材料或試劑的使用，如條件化培養基、PA6滋養層細胞、Bowman’s膜或羊膜等。滋養層容易引入動物源病原體，同時滋養層的類型、傳代次數及生長狀態均對誘導效率產生較大影響，而組分不明確的材料或試劑批次間可能會存在較大差異，這些因素影響了誘導技術的穩定性和再現性。此外，有些方法并未報道誘導的細胞是否可以進一步分化為成熟的角膜上皮細胞，或者分化效率非常的低。

小分子誘導技術是利用小分子誘導劑調節細胞外信號通路，模擬細胞的發育過程，高效的誘導了多能干細胞向心肌細胞、神經細胞等細胞類型的分化，是無動物源、體外誘導技術建立的重要基礎。本發明的發明人結合現有角膜緣干細胞(imbal stem cells，LSC)發育和體外誘導技術基礎，結合LSC發育途徑，建立穩定、高效的LSC誘導技術，并在體外證實可以通過多能干細胞獲得類角膜緣干細胞。為此，本發明提供了一種體外誘導類角膜緣干細胞的方法。