[發(fā)明專利]體外誘導(dǎo)類角膜緣干細(xì)胞的方法及試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010459246.0
• 申請(qǐng)日: 2020-05-27
• 公開（公告）號(hào): CN113736735A
• 公開（公告）日: 2021-12-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫長(zhǎng)斌;張曦
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳華大生命科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12N5/0797
• 分類號(hào): C12N5/0797;C12N5/079
• 代理公司: 北京清亦華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11201
• 代理人: 肖陽(yáng)

1.一種體外誘導(dǎo)類角膜緣干細(xì)胞的方法，其特征在于，包括：

(1)利用第一誘導(dǎo)劑對(duì)多能干細(xì)胞進(jìn)行第一培養(yǎng)，以便獲得表面外胚層細(xì)胞，所述第一誘導(dǎo)劑包括第一小分子抑制劑和第一蛋白，所述第一小分子抑制劑包括TGF-beta/Smad抑制劑，所述第一蛋白包括選自bFGF或BMP4中的至少一種；

(2)利用第二誘導(dǎo)劑對(duì)所述表面外胚層細(xì)胞進(jìn)行第二培養(yǎng)，以便獲得類角膜緣干細(xì)胞，所述第二誘導(dǎo)劑包括第二蛋白，所述第二蛋白包括BMP4。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述TGF-beta/Smad抑制劑包括選自SB505124或SB431542中的至少一種。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)進(jìn)一步包括：

(1-1)利用含有第一小分子抑制劑和bFGF的第一表面外胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)所述多能干細(xì)胞進(jìn)行第一誘導(dǎo)培養(yǎng)；

(1-2)更換含有第一小分子抑制劑和BMP4的第二表面外胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)步驟(1-1)的產(chǎn)物進(jìn)行第二誘導(dǎo)培養(yǎng)，以便獲得所述表面外胚層細(xì)胞。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)進(jìn)一步包括：

(2-1)利用含有BMP4的第一角膜緣干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)所述表面外胚層細(xì)胞進(jìn)行第三誘導(dǎo)培養(yǎng)；

(2-2)更換不含有BMP4的第二角膜緣干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)步驟(2-1)的產(chǎn)物進(jìn)行第四誘導(dǎo)培養(yǎng)，以便獲得所述類角膜緣干細(xì)胞。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一表面外胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括選自DMEM/F12培養(yǎng)基或E6培養(yǎng)基中的至少一種，進(jìn)一步包括選自胎牛血清、血小板裂解物或替代物中的至少一種；

任選地，所述第二表面外胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括選自DMEM/F12培養(yǎng)基或E6培養(yǎng)基中的至少一種，進(jìn)一步包括選自胎牛血清、血小板裂解物或替代物中的至少一種。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一角膜緣干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括選自DMEM/F12培養(yǎng)基或角膜上皮培養(yǎng)基中的至少一種，進(jìn)一步包括選自胎牛血清、血小板裂解物或替代物中的至少一種；

任選地，所述第二角膜緣干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括選自DMEM/F12培養(yǎng)基或角膜上皮培養(yǎng)基中的至少一種，進(jìn)一步包括選自胎牛血清、血小板裂解物或替代物中的至少一種。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，在所述第一誘導(dǎo)培養(yǎng)中，所述第一小分子誘導(dǎo)劑的使用濃度為5～15μM，在所述第二誘導(dǎo)培養(yǎng)中，所述第一小分子誘導(dǎo)劑的使用濃度為0～15μM。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一蛋白的使用濃度為5～50ng/mL；

任選地，所述第二蛋白的使用濃度為5～15ng/mL。