[發明專利]一種用于檢測阪琦腸桿菌的試劑盒、引物對、探針及方法

在審

• 申請號: 202010450810.2
• 申請日: 2020-05-25
• 公開（公告）號: CN111518935A
• 公開（公告）日: 2020-08-11
• 發明（設計）人: 蔣蔚;韓先干;王權;張欣
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院上海獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 薛琦;呂學辰

本發明公開了一種用于檢測阪琦腸桿菌的試劑盒、引物對、探針及方法。所述的試劑盒包括RPA反應體系，所述的RPA反應體系包括RPA引物探針混合液，所述RPA引物探針混合液包括一引物對和探針，所述引物對中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探針的核苷酸序列包含分別如SEQ ID NO.3所示、和如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。本發明的試劑盒、引物、探針及其組合特異性強、靈敏度高、檢測結果準確，且具有快速、操作簡單、結果判讀簡單等優點。

技術領域

本發明屬于食源性致病菌快速診斷技術領域，具體涉及一種用于檢測阪琦腸桿菌的試劑盒、引物對、探針及方法。

背景技術

阪琦腸桿菌(Enterobacter sakazakii)是革蘭氏陰性兼厭氧型菌^[1]，屬于腸桿菌科，作為危害嬰幼兒和免疫力低下人群的關鍵致病菌^[2]，廣泛存在于環境及配方奶粉中。阪琦腸桿菌作為具有安全隱患的食源性致病菌之一，國際上對其防控研究越來越重受到重視。建立針對該菌的檢測方法快速準確檢測該菌，降低感染及致病性風險就顯得尤為重要。目前對阪琦腸桿菌的檢測方法主要是分離培養法，然而傳統檢測方法存在許多不足，如操作方法繁瑣、耗時周期長大致需要4-6天、靈敏度較低且容易造成假陽性污染，使得對該菌的快速診療帶來極大的挑戰。分子生物學檢測方法具有快速靈敏度高等優點，為了滿足快速準確的檢測需求，利用阪琦腸桿菌特異性基因設計鑒定引物，建立以PCR檢測技術為主的分子生物檢測成為該菌檢測的首要方法。但是，由于PCR^[3，4]檢測方法具有操作繁瑣，假陽性污染的風險，且對擴增儀器的要求較高，價格昂貴，對實驗操作人員要求較高等缺點，使得該方法只適用于實驗室檢測，極大限制了該檢測方法在基層的推廣和使用。因此建立檢測快速，準確性及靈敏度高，且對儀器設備要求較低的新型檢測技術對于阪琦腸桿菌在基層的快速檢測具有十分重要的意義。

重組酶聚合酶擴增技術(RPA)是由ASM Scientific公司推出的核酸恒溫擴增技術^[5，6]，具有特異性強、靈敏快速等特點。和普通PCR原理相似的是雙鏈DNA的解旋和擴增都需要重組酶和聚合酶來完成，不同的是，RPA不需要高溫加熱解旋DNA雙鏈，而是通過重組酶在DNA模板上尋找同源序列，定位后通過雙鏈DNA同源位點互換形成穩定的D-Loop結構。在25-45℃恒溫條件下就可以進行擴增，且整個反應過程只需要20min，其擴增產物可以和瓊脂糖凝膠電泳分析、實時熒光定量測定法及橫向流動試紙條檢測法等方法結合，具有直觀性。與其他等溫擴增技術相比，不需要昂貴的實驗儀器，且具有特異性強、靈敏度高、快速、操作簡便、適用于現場快速診斷等特點^[5，7]，為疾病早期診斷及時治療提供了極大的可行性。目前有文獻報道該快速檢測技術廣泛應用在細菌、病毒和寄生蟲的檢測和醫學、食品檢測等領域^[8，9]。

常規RPA產物使用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，具有操作簡單，費用低廉等優點，但是在進行檢測之前需要用產物純化試劑盒進行純化，否則造成拖帶難以進行實驗結果分析。本研究將重組酶聚合酶擴增技術與側流層析試紙條結合，在擴增過程中添加帶生物素biotin標記的引物和帶羧基熒光素FAM標記的探針，使得擴增產物同時帶有生物素和熒光素標記的雙標記擴增產物，這種擴增產物使用基于“夾心法”的側流試紙條進行檢測。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是為克服現有技術中檢測阪琦腸桿菌耗時長、操作繁瑣、需要昂貴儀器、需要專業技術人員、且靈敏度低等的缺陷，提供一種用于檢測阪琦腸桿菌的試劑盒、引物對、探針及方法，所述的試劑盒包括RPA反應體系，所述的RPA反應體系包括RPA引物探針混合液，所述RPA引物探針混合液包括一引物對和探針，所述引物對中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述探針包含如SEQ ID NO.3所示、以及如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。