[發(fā)明專利]一種用于檢測(cè)阪琦腸桿菌的試劑盒、引物對(duì)、探針及方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010450810.2
• 申請(qǐng)日: 2020-05-25
• 公開（公告）號(hào): CN111518935A
• 公開（公告）日: 2020-08-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔣蔚;韓先干;王權(quán);張欣
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 上海弼興律師事務(wù)所 31283
• 代理人: 薛琦;呂學(xué)辰

1.一種用于檢測(cè)阪琦腸桿菌(Enterobacter sakazakii)的試劑盒，其包括RPA反應(yīng)體系，其特征在于，所述的RPA反應(yīng)體系包括RPA引物探針混合液，所述RPA引物探針混合液包括一引物對(duì)和探針，所述引物對(duì)中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述探針包含如SEQ ID NO.3所示以及如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述下游引物的5’端采用生物素進(jìn)行標(biāo)記；

和/或，所述探針的5’端采用異硫氰酸熒光素標(biāo)記，所述探針的3’端標(biāo)記Spacer C3；較佳地，標(biāo)記后的探針如式：5’-FAM-SEQ ID NO.3-THF-SEQ ID NO.4-Spacer C3-3’所示。

3.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述的RPA反應(yīng)體系包括：2.1μL濃度為10μM的所述上游引物、2.1μL濃度為10μM的所述下游引物、0.6μL濃度為10μM的所述探針、29.5μL水化緩沖液、12.2μL雙蒸水以及2.5μL濃度為280μM的醋酸鎂；

較佳地，所述的試劑盒還包括陰性對(duì)照和/或陽(yáng)性對(duì)照；

所述的陰性對(duì)照優(yōu)選雙蒸水；

所述的陽(yáng)性對(duì)照優(yōu)選阪琦腸桿菌DNA。

4.如權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述的RPA為RPA-LF。

5.一種用于檢測(cè)阪琦腸桿菌的引物對(duì)，其特征在于，所述引物對(duì)中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

較佳地，所述的上游引物的5’端采用生物素進(jìn)行標(biāo)記。

6.如權(quán)利要求5所述的引物對(duì)，其特征在于，所述的檢測(cè)為RPA檢測(cè)，優(yōu)選RPA-LF檢測(cè)。

7.一種用于檢測(cè)阪琦腸桿菌的探針，其特征在于，所述的探針含如SEQ ID NO.3所示以及如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；較佳地，所述探針的5’端采用異硫氰酸熒光素標(biāo)記，所述探針的3’端標(biāo)記Spacer C3；更佳地，標(biāo)記后的探針如式：5’-FAM-SEQ ID NO.3-THF-SEQ ID NO.4-Spacer C3-3’所示；

其中，所述的檢測(cè)優(yōu)選RPA檢測(cè)，更優(yōu)選RPA-LF檢測(cè)。

8.一種用于檢測(cè)阪琦腸桿菌的寡核苷酸組合，所述的寡核苷酸組合包括如權(quán)利要求5或6所述的引物對(duì)，以及如權(quán)利要求7所述的探針；

較佳地，所述的檢測(cè)為RPA檢測(cè)，優(yōu)選RPA-LF檢測(cè)。

9.如權(quán)利要求6所述的引物對(duì)、如權(quán)利要求7所述的探針，或者權(quán)利要求8所述的寡核苷酸組合在制備檢測(cè)阪琦腸桿菌的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

10.一種非診斷目的的檢測(cè)阪琦腸桿菌的方法，其特征在于，其包括如下步驟：

(1)使用DNA提取試劑提取待檢樣品中的總DNA；

(2)以步驟(1)提取的總DNA為模板，利用權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述試劑盒中的RPA反應(yīng)體系進(jìn)行RPA反應(yīng)，所述RPA反應(yīng)中擴(kuò)增反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選15min、溫度優(yōu)選39℃；所述的RPA優(yōu)選RPA-LF；

(3)分析檢測(cè)結(jié)果；其中：

步驟(2)中所得擴(kuò)增產(chǎn)物較佳地為一端標(biāo)記熒光素，一端標(biāo)記生物素的雙標(biāo)記產(chǎn)物；

和/或，步驟(3)中的分析方法較佳地為用GenLine HybriDetect MGHD1膠體金側(cè)流層析試紙條對(duì)所述雙標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，所述雙標(biāo)記產(chǎn)物優(yōu)選為稀釋后的雙標(biāo)記產(chǎn)物。