[發明專利]一種基于CD90posi細胞檢測腫瘤的試劑盒

在審

• 申請號: 202010443528.1
• 申請日: 2020-05-22
• 公開（公告）號: CN111549138A
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發明（設計）人: 劉建平;蘇正;張克幍
• 申請（專利權）人: 中山大學孫逸仙紀念醫院
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京中譽至誠知識產權代理事務所(普通合伙) 11858
• 代理人: 張平力

本發明提供一種基于CD90posi細胞檢測腫瘤的試劑盒，包括：通過對肝癌細胞中CD90posi亞群總RNA構建CircRNA文庫，進行CircRNA的高通量測序或分離肝癌患者腫瘤組織CD90posi細胞總RNA，進行CircRNA高通量測序。根據測序情況，對結果進行生物信息學分析，采集差異表達的分子，進行基因GO、Pathway富集等生信分析，篩選出差異表達的候選CircRNA并做細胞學驗證，對候選CircRNA在病人血清中的表達與CD90posi細胞群數量及腫瘤進展做相關性分析，評價CircRNA作為腫瘤檢測血清標志物和治療靶點的可行性。

技術領域

本發明涉及液體診斷方法領域，尤其涉及一種基于CD90posi細胞檢測腫瘤的試劑盒。

背景技術

原發性肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率較高，每年約有60萬以上的患者死于肝癌，病死率位居國內腫瘤第二位，嚴重威脅人民群眾的生命健康。肝癌起病隱匿，臨床表現缺乏特別性，患者就醫時往往處于肝癌中晚期，肝癌早期患者難以發現，嚴重影響肝癌的治療效果。目前肝癌的臨床檢測手段主要通過檢測患者血清甲胎蛋白(AFP)并結合影像學檢查進行確診，可分為以下幾類：B超檢查，B超受腸氣及周圍臟器的影響，分辨率較低；雖可在B超引導下進行肝臟占位病灶穿刺活檢，但肝穿刺的病理診斷存在一定假陰性率；同時肝臟穿刺存在肝創面出血、腫瘤隨針道轉移等嚴重并發癥，限制了其臨床應用。CT與磁共振成像：CT或MR僅能分辨直徑1.0cm以上的病灶，且仍有一定的假陽性率與假陰性率。DSA技術：雖可提高肝癌檢測的準確率，但DSA為一種侵入性創傷性檢查，多用于肝癌治療，檢測范圍和實用性受到極大限制。

隨著分子生物學技術進步，人類對疾病的認識從宏觀到微觀，從環境到基因，從遺傳到表觀遺傳，逐步深入。越來越多的學者認為，腫瘤的發生是多因素協同作用的結果。以表觀遺傳為例，基因5’端啟動子區DNA甲基化能影響啟動子活性，而miRNA則從3’UTR區發揮調控功能，二者既能協同作用，也能相互制約，研究發現，約10％的miRNA表達受到DNA甲基化的影響；而circRNA可作為miRNA海綿或緩沖劑，通過吸附或釋放miRNA來影響靶基因表達。

通過對肝細胞癌微環境細胞群的分析，篩選出CD90posi腫瘤細胞，發現CD90posi細胞促進肝癌細胞的增殖、遷移。同時，CD90posi細胞表現出很強的增殖潛力和細胞干性。將CD90posi肝癌細胞和腫瘤細胞系中其他側群細胞按不同比例混合，并注射于裸鼠皮下，發現隨著CD90posi細胞所占比例增加，移植的腫瘤體積和重量越大，表明CD90posi細胞是肝細胞癌增殖和生長的關鍵因素。

進一步，在CD90posi細胞中發現GLI1/3轉錄因子的高表達，并通過分子表達干預、分子抑制劑使用等實驗手段，在培養的肝癌細胞和移植的裸鼠皮下干細胞癌中證明了GLI1/3促進CD90posi細胞的分化，并激活IL-6/STAT3信號通路，促進腫瘤細胞的增殖。并且，在大多數原發性肝癌患者中檢測CD90的表達，并在隨訪研究中證明CD90高表達的肝癌患者預后較差。這與TCGA肝癌大數據的統計結果一致。

在肝癌細胞系Huh7和97L中分離出CD90posi腫瘤細胞，并對細胞進行CircRNA-Seq的工作，利用生物信息學的分析方法，篩選出差異表達的CircRNA分子，并根據序列相關性的原則分析了CircRNA母本基因的GO功能通路富集情況。結果顯示，CircRNA在CD90posi肝癌細胞中的存在較顯著的差異表達，這些差異表達的基因參與了腫瘤細胞的能量代謝、信號轉導、蛋白泛素化降解和基因表達調控等重要過程，CircRNA或許可以作為原發性肝癌檢測和篩查的分子指標。一方面CircRNA的變化反應了細胞代謝和信號轉導的異常；另一方面，CircRNA可以表征CD90在腫瘤組織中的表達水平。