[發(fā)明專利]脫落乳牙的牙髓干細(xì)胞聚合體及其制備方法和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010439933.6
• 申請(qǐng)日: 2020-05-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111548990A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊濤;楊鳴謙
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳至博生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0775
• 分類號(hào): C12N5/0775;C12Q1/6888;A61K35/28;A61P1/02;A61P29/00
• 代理公司: 上海弼興律師事務(wù)所 31283
• 代理人: 薛琦;黃益澍

本發(fā)明公開(kāi)了一種脫落乳牙的牙髓干細(xì)胞聚合體的制備方法，及由該制備方法制得的牙髓干細(xì)胞聚合體及其在制備用于恒牙再植的制劑中的用途。本發(fā)明的制備方法包括以下步驟：(1)將來(lái)自于脫落乳牙的牙髓組織洗凈；(2)所述牙髓組織經(jīng)膠原酶I和Dispase消化并獲得細(xì)胞懸液；(3)加入VC培養(yǎng)液培養(yǎng)以獲得牙髓干細(xì)胞聚合體；具體方法見(jiàn)下文。本發(fā)明的脫落乳牙的牙髓干細(xì)胞不僅有間充質(zhì)干細(xì)胞特性，同時(shí)表達(dá)胚胎性干細(xì)胞相關(guān)基因，其誘導(dǎo)分化能力強(qiáng)于牙髓干細(xì)胞，對(duì)完全脫位年輕恒牙的牙髓再生及牙周愈合有理想的效果。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種脫落乳牙的牙髓干細(xì)胞聚合體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

牙齒再生的最終理想目標(biāo)是用一顆再生的天然牙齒取代損失的牙齒。而乳牙干細(xì)胞正是修復(fù)受損或病變牙組織，甚至牙齒脫落后進(jìn)行整體修復(fù)的絕佳治療方案。2003年，美國(guó)施松濤教授課題組首次從脫落乳牙的冠和根的牙髓中分離出具有多分化能力的干細(xì)胞，將其命名為脫落乳牙牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞(stem cells from human exfoliated deciduousteeth,SHED)。

脫落乳牙牙髓干細(xì)胞與牙髓干細(xì)胞(DPSC)、根尖牙乳頭干細(xì)胞(SCAP)均為牙源性干細(xì)胞且都來(lái)源于神經(jīng)峭間充質(zhì)細(xì)胞，但SHED是發(fā)育更早期的胚胎源性細(xì)胞，因此其增殖水平、群體倍增數(shù)、克隆形成能力、多向分化能力均顯著高于二者。研究顯示SHED除了具有成牙本質(zhì)/牙髓分化，還可以分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞等。另外SHED還具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能，可以抑制Th17細(xì)胞活性，維持機(jī)體的免疫平衡。基于上述SHED優(yōu)越的生物學(xué)性能，一些研究者應(yīng)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型進(jìn)行SHED嘗試性治療皮膚傷口、顱骨缺損、脊髓損傷、免疫疾病、肝損傷等，均取得了良好的治療效果。脫落乳牙牙髓干細(xì)胞有廣闊的應(yīng)用前景，探索、優(yōu)化和開(kāi)發(fā)此干細(xì)胞的制備過(guò)程及新的應(yīng)用形式，不僅有利于保證脫落乳牙牙髓干細(xì)胞的生物學(xué)特性和效應(yīng)，而且為開(kāi)展大規(guī)模臨床試驗(yàn)治療奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)并提供了有力的保障。例如CN105087474A公開(kāi)了一種乳牙牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其乳牙來(lái)源是臨床上兒童因滯留而拔除的乳切牙。CN105087474A所公開(kāi)的乳牙牙髓干細(xì)胞制備培養(yǎng)方法是牙髓組織膠原酶I消化后過(guò)篩，無(wú)血清培養(yǎng)，且加入表皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維生長(zhǎng)因子。CN105602895A所公開(kāi)的乳牙牙髓干細(xì)胞制備培養(yǎng)方法是牙髓組織切塊后，直接用間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)(FasGrow)，添加因子為重組人血小板源生長(zhǎng)因子、重組人表皮生長(zhǎng)因子的混合物。這兩個(gè)專利所公開(kāi)的培養(yǎng)方法都是無(wú)血清培養(yǎng)、添加生長(zhǎng)因子。血清含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，在促進(jìn)干細(xì)胞增殖方面有很好的效果，并且對(duì)干細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)、集落形成有重大影響，但過(guò)高濃度不利于干細(xì)胞生長(zhǎng)。外源性生長(zhǎng)因子對(duì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，但也有人認(rèn)為多種生長(zhǎng)因子對(duì)干細(xì)胞生長(zhǎng)并無(wú)協(xié)同作用。因此，添加生長(zhǎng)因子的有益作用可能不足以補(bǔ)充無(wú)血清培養(yǎng)帶來(lái)的影響，脫落乳牙牙髓干細(xì)胞的制備方法和培養(yǎng)仍需不斷優(yōu)化和改進(jìn)。

目前牙再生所采用的各種種子細(xì)胞多存在供源有限的問(wèn)題，相對(duì)于從阻生牙和正畸拔除牙中獲取牙源性干細(xì)胞，脫落乳牙是一個(gè)更容易獲得種子細(xì)胞的途徑，目前國(guó)外己經(jīng)建立了多個(gè)SHED干細(xì)胞庫(kù)。牙齒發(fā)育生物學(xué)研究顯示牙齒的發(fā)育模式是由上皮和間充質(zhì)細(xì)胞的凝聚細(xì)胞團(tuán)相互作用的結(jié)果，因此金巖教授課題提出了一種新的組織工程牙齒構(gòu)建方法——細(xì)胞聚合體組織工程(cell aggregate engineering)。其主要原理是將牙源性干細(xì)胞經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)制成適宜形態(tài)的細(xì)胞團(tuán)塊進(jìn)而移植至體內(nèi)，最終原位發(fā)育成組織工程牙齒組織。細(xì)胞聚合體技術(shù)通過(guò)細(xì)胞自身分泌的細(xì)胞外基質(zhì)形成內(nèi)源性支架(endogenousscaffold)，有利于細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與胞外基質(zhì)間的交互作用和遺傳信息的傳遞，有利于維持細(xì)胞三維有序的發(fā)育空間，有利于細(xì)胞外基質(zhì)的分泌和局部微環(huán)境的建立，進(jìn)而有利于組織工程牙齒組織的形態(tài)發(fā)生。脫落乳牙牙髓干細(xì)胞聚合體是由脫落乳牙牙髓干細(xì)胞與其分泌的基質(zhì)蛋白所形成的機(jī)能環(huán)境或者微環(huán)境，含有牙齒發(fā)育所需生物因子、具有牙源性特征且形成了牙齒固有膠原網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，具有細(xì)胞懸液所沒(méi)有的穩(wěn)定的生物學(xué)特性、堅(jiān)韌的機(jī)械特性及獨(dú)特的誘導(dǎo)微環(huán)境。