[發明專利]脫落乳牙的牙髓干細胞聚合體及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202010439933.6
• 申請日: 2020-05-22
• 公開（公告）號: CN111548990A
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發明（設計）人: 楊濤;楊鳴謙
• 申請（專利權）人: 深圳至博生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12Q1/6888;A61K35/28;A61P1/02;A61P29/00
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 薛琦;黃益澍

1.一種脫落乳牙的牙髓干細胞聚合體的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟：

(1)將來自于脫落乳牙的牙髓組織洗凈，其中所述脫落乳牙為自然脫落或松動后經人工拔除，所述洗凈為反復用PBS沖洗至表面無血液殘留；

(2)所述牙髓組織經膠原酶I和Dispase消化至無成形牙髓組織，終止消化后獲得細胞懸液，其中所述膠原酶I的濃度為100-300CDU/mL，所述Dispase的濃度為1-2.4U/mL；

(3)加入20-40mg/mL VC培養液培養以獲得牙髓干細胞聚合體。

2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，在所述步驟(2)后、所述步驟(3)之前還包括以下步驟：

(2.1)將所述細胞懸液用含血清和抗生素的a-MEM培養基培養，以獲得牙髓干細胞；優選培養所述牙髓干細胞至80-85％匯合度；

(2.2)PBS沖洗所述牙髓干細胞，優選沖洗2-3遍；和/或，

(2.3)用胰蛋白酶消化所述牙髓干細胞以獲得含單細胞的細胞懸液；

優選地，還包括以下步驟：

(2.4)檢測所述牙髓干細胞的間充質干細胞標志物和/或胚胎干細胞標志物，和/或，在誘導成骨、成脂后檢測成骨相關基因和/或成脂相關基因的表達；所述檢測的結果為陽性。

3.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)為：

以1-10×10⁵/孔接種所述牙髓干細胞，并加入20-40mg/mL VC培養液培養后獲得牙髓干細胞聚合體，和/或，所述培養為培養12-14天；優選地，所示膠原酶I的濃度為200CDU/mL，所述Dispase的濃度為2U/mL，所述VC培養液的濃度為30mg/mL，和/或，所述接種以6-8×10⁵/孔優選7×10⁵/孔接種。

4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，在所述步驟(2)中，所述消化為在37℃孵箱內消化40min-1h，優選每隔5-l0min輕輕搖晃。

5.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，

在所述步驟(2.1)中，所述血清為10％胎牛血清，所述抗生素為100U/mL青霉素和/或鏈霉素，所述培養在37℃、CO₂飽和度為5％的恒溫箱培養。

6.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，

在所述步驟(2.3)中，所述胰蛋白酶的濃度為2-3％優選2.5％，所述消化的溫度為37℃，和/或，所述消化的時間為30-60s優選40s。

7.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，

在所述步驟(2.4)中，所述間充質干細胞標志物為Stro-1、CD34、CD45、CD90、CD105和CD146中的一種或多種，所述胚胎干細胞標志物為Oct4和/或Nanog，所述成骨相關基因為ALP、OCN、COL-1、RUNX-2，所述成脂相關基因為PPAR-r、LPL；優選地，所述間充質干細胞標志物使用流式細胞儀檢測，所述胚胎干細胞標志物、所述成骨相關基因和/或成脂相關基因使用RT-PCR檢測。

8.一種由權利要求1-7中任一項所述的制備方法制得的牙髓干細胞聚合體。

9.如權利要求8所述的牙髓干細胞聚合體在制備用于恒牙再植的制劑中的用途。

10.如權利要求8所述的用途，其特征在于，所述恒牙為年輕恒牙，優選完全脫位的年輕恒牙；更優選地，所述乳牙牙髓干細胞聚合體具有：抗炎癥反應、抑制細胞凋亡、促進細胞增殖和血管生成的作用，和/或，可促進恒牙的牙髓再生及牙周愈合。