[發明專利]一種非診斷目的的基于長鏈DNA支架的DNA納米帶的circRNA的檢測方法

有效

• 申請號: 202010439342.9
• 申請日: 2020-05-22
• 公開（公告）號: CN111549104B
• 公開（公告）日: 2022-08-19
• 發明（設計）人: 項陽;焦瑾;李根喜
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12Q1/682
• 分類號: C12Q1/682
• 代理公司: 江蘇銀創律師事務所 32242
• 代理人: 何紅梅

本發明公開了一種非診斷目的的基于長鏈DNA支架的DNA納米帶的circRNA的檢測方法，包括如下步驟：(1)設計一個環狀DNA模板，該模板上含有發夾探針H₁和發夾探針H₂兩種安裝位點，以及可以特異性識別靶標BSJ位點的序列片段；(2)以該環狀DNA為模板；(3)將發夾探針H₁和發夾探針H₂通過自組裝結合在長鏈DNA上，所述的發夾探針H₂包含熒光基團HEX和猝滅基團BHQ1，(4)最終合成了一種BSJ位點驅動的基于長鏈DNA支架的DNA納米帶。本發明的DNA納米帶可以特異性的識別目標circRNA，用于復雜生物樣品中circRNA的直接分析。

技術領域

本發明涉及生物分析化學領域，尤其涉及一種基于RCA產物長鏈為支架的并由環狀RNA(circular RNA，circRNA)驅動長鏈上發生級聯雜交擴增的DNA 納米帶的構建及應用，具體為構建一種新型的DNA納米探針，由circRNA驅動，實現在復雜的生物樣本中對circRNA的快速直接檢測與分析。

背景技術

circRNA是一種新型的非編碼RNA，具有共價閉合的環狀結構。研究發現， circRNA具有抗外切酶活性的特性(比線性RNA具有更高的穩定性)，常表現為組織或發育階段特異性表達。circRNA也被認為是一種高效的天然microRNA (miRNA)海綿，大量研究表明circRNA比miRNA更適合用于腫瘤研究并充當腫瘤標志物。miRNA通過競爭性內源RNA(ceRNA)機制的吸附可能調節下游基因的表達，從而在疾病的發生發展中發揮重要的調控作用。例如， hsa_circRNA_0007874(circ-MTO1)可以通過下調miR-9的表達來抑制肝癌的進展。肝癌患者腫瘤細胞中circ-MTO1的表達量降低與患者生存率降低緊密相關，提示circ-MTO1是一個潛在的肝癌預后生物標志物。因此，建立穩健的 circRNA分析方法，對腫瘤的診斷、藥效學監測和預后評價都具有重要的臨床意義。

circRNA具有獨特的閉環結構，與miRNAs和其它線性RNA不同，circRNA 不易通過電泳等常用的分子技術或基于聚腺苷自由RNA末端的方法與其它種類 RNA分離。因此，近年來出現的大量新穎有效分析mRNA和miRNA的方法，幾乎均不適合于circRNA的分析。此外，內源性circRNA的豐度普遍較低，體液中的circRNA難以獲得，對其進行分析需要從大量樣品中提取和純化 circRNA，這部分操作具有一定的難度和挑戰性。例如，實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qPCR)是目前分析circRNA表達最常用的實驗方法。在qPCR中，首先用RNase-R對樣品進行預處理，然后提取樣品中的RNA，通過反轉錄將 circRNA轉化為線性cDNA，隨后進行擴增步驟，該方法具有高實驗成本和高設計復雜度的特點。此外，circRNA的逆轉錄酶可能會引入大量的模板轉換產物和鏈移位，從而極易導致假陽性結果。近年來，我們也構建了一種基于RNase-R 的circRNA表達分析方法，該方法雖然在特異性circRNA的定量檢測方面取得了成功，但仍存在試劑昂貴、操作復雜等缺點。特別是，繁瑣的提取和純化步驟可能會妨礙circRNA的準確定量。

因此，開發在復雜的生物樣品中直接，快速，有效地分析circRNA的方法是勢在必行的。

由非標準剪接事件產生circRNA的過程稱為反剪接，在反剪接過程中形成了circRNA的保守域反剪接連接位點(BSJ)，circRNA的特異性分析均依賴于 BSJ位點的精準識別。非酶催化發夾組裝信號放大反應(CHA)在核酸的檢測和分析中具有廣泛的應用。然而，在實際生物樣品(如細胞內，血液和細胞裂解液)中的CHA反應的實用性仍然是有限的，部分原因是樣品介質的復雜背景給游離DNA發夾的擴散帶來了不可忽視的阻力。結合以上事實，我們設計了一種能被circRNA點亮的DNA納米帶(DNT)，該DNA納米帶可以特異性的識別目標circRNA，用于復雜生物樣品中circRNA的直接分析。

發明內容