[發(fā)明專利]一種非診斷目的的基于長鏈DNA支架的DNA納米帶的circRNA的檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010439342.9
• 申請日: 2020-05-22
• 公開（公告）號: CN111549104B
• 公開（公告）日: 2022-08-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 項(xiàng)陽;焦瑾;李根喜
• 申請（專利權(quán)）人: 南京大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/682
• 分類號: C12Q1/682
• 代理公司: 江蘇銀創(chuàng)律師事務(wù)所 32242
• 代理人: 何紅梅

1.一種非診斷目的的基于長鏈DNA支架的DNA納米帶的circRNA的檢測方法，其特征在于包括如下步驟：(1)設(shè)計(jì)一個(gè)環(huán)狀DNA模板，該模板上含有發(fā)夾探針H 1 和發(fā)夾探針H 2兩種安裝位點(diǎn)，以及特異性識別靶標(biāo)circRNA的BSJ位點(diǎn)的序列片段；

(2)以該環(huán)狀DNA為模板，采用滾環(huán)擴(kuò)增法RCA合成DNA長鏈作為DNA納米帶的支架；

(3)將發(fā)夾探針H 1 和發(fā)夾探針H 2 通過自組裝結(jié)合在長鏈DNA上，所述的發(fā)夾探針H1 的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述的發(fā)夾探針H 2 的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述的發(fā)夾探針H 2 包含熒光基團(tuán)HEX和猝滅基團(tuán)BHQ1，得到被circRNA驅(qū)動發(fā)生發(fā)夾探針H 1 和發(fā)夾探針H 2 級聯(lián)雜交反應(yīng)的DNA納米帶；

(4)在樣品中，circRNA的BSJ位點(diǎn)通過特異性識別與H1探針雜交，被打開的發(fā)夾探針H1 進(jìn)而與發(fā)夾探針H 2 雜交，此時(shí)circRNA被重新釋放，發(fā)夾探針H 2 上的熒光基團(tuán)HEX遠(yuǎn)離猝滅基團(tuán)恢復(fù)熒光；

(5)基于鄰位效應(yīng)的優(yōu)勢，被釋放下來的靶標(biāo)circRNA接著與DNA納米帶下游的發(fā)夾探針H 1 和發(fā)夾探針H 2 持續(xù)發(fā)生雜交置換反應(yīng)，點(diǎn)亮整條DNA納米帶；并且一個(gè)circRNA持續(xù)點(diǎn)亮多個(gè)DNA納米帶，在20分鐘內(nèi)即可產(chǎn)生明顯的熒光信號增強(qiáng)，從而能夠在復(fù)雜基質(zhì)中直接檢測circRNA。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非診斷目的的基于長鏈DNA支架的DNA納米帶的circRNA的檢測方法，其特征在于：在步驟(1)中，首先制備環(huán)狀DNA模板，混合2μL 10×T₄DNA連接緩沖液，1μL磷酸化的100μM的線性模板和100μM的5μL連接輔助鏈，在65℃金屬浴加熱30min并緩慢降至室溫，加入11μL DEPC處理水和100U/μL的1μL T₄DNA連接酶，然后混合均勻于25℃下孵育2h，然后于65℃加熱10min終止反應(yīng)；接下來用外切酶Ⅰ、外切酶Ⅲ消化未形成環(huán)的線性模板鏈和連接輔助鏈，再經(jīng)過PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化獲得環(huán)狀DNA模板。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的非診斷目的的基于長鏈DNA支架的DNA納米帶的circRNA的檢測方法，其特征在于：在步驟(2)中，DNA模板滾環(huán)擴(kuò)增的步驟如下：在25μL的RCA反應(yīng)體系中加入1μL環(huán)狀DNA模板，2.5μL 10×Phi29緩沖液，10mg/mL的0.5μL BSA，10mM的6μL dNTPs，10nM的2.5μL連接DNA，13μL DEPC-H₂ O和10U/μL的0.5μL Phi29 DNA聚合酶；將該體系于37℃下孵育90分鐘，在65℃下熱處理10分鐘，以停止反應(yīng)，最后，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，并通過Thermo-NanoDrop 2000測定了純化的RCA產(chǎn)物濃度，用于RCA反應(yīng)的環(huán)狀DNA模板和RCA產(chǎn)物均于-20℃保存。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非診斷目的的基于長鏈DNA支架的DNA納米帶的circRNA的檢測方法，其特征在于：在步驟(3)中，DNA納米帶包括一個(gè)長DNA單鏈和發(fā)夾探針H 1 和發(fā)夾探針H 2 ；

首先，將長鏈DNA，H 1 和H 2 分別于95℃孵育5分鐘，并緩慢冷卻至室溫，為了組裝DNA納米帶，將以下物質(zhì)添加到200μL離心管中：10μM的25μL H 1 ，10μM的25μL H 2 ，0.6μM的25μL長鏈 DNA和500mM，pH為8.0的125μL Tris-MgCl₂緩沖液，混合均勻后于37℃下孵育2小時(shí)，發(fā)夾探針H 1 和發(fā)夾探針H 2 經(jīng)過自組裝結(jié)合到長DNA鏈上，制得DNA納米帶。