[發明專利]一株產L-高絲氨酸的谷氨酸棒桿菌突變株的構建與應用

有效

• 申請號: 202010439183.2
• 申請日: 2020-05-22
• 公開（公告）號: CN111471638B
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發明（設計）人: 周景文;陳堅;李寧;曾偉主;堵國成
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/77;C12P13/06;C12R1/15
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

發明公開了一株產L?高絲氨酸的谷氨酸棒桿菌突變株的構建與應用，屬于發酵工程技術領域。本發明以谷氨酸棒桿菌ATCC 13032為出發菌株，敲除調控蛋白McbR、高絲氨酸激酶、轉運蛋白MetD、磷酸烯醇丙酮酸羧激；下調表達異檸檬酸脫氫酶；過表達轉運蛋白BrnFE、天冬氨酸半醛脫氫酶、高絲氨酸脫氫酶；并且提高天冬氨酸激酶、丙酮酸羧化酶以及來源于大腸桿菌的天冬氨酸激酶I的表達。所述突變株搖瓶培養48h，L?高絲氨酸的產量可達到8.8g/L。

技術領域

本發明涉及一株產L-高絲氨酸的谷氨酸棒桿菌突變株的構建與應用，屬于發酵工程技術領域。

背景技術

作為一種四碳氨基酸，L-高絲氨酸是一種有潛力的平臺化合物，用于合成甲硫氨酸、γ-丁內酯(γ-butyrolactone)等化合物。雖然L-高絲氨酸不是蛋白合成氨基酸，但是它可以是一些重要含硫化合物的前體(L-甲硫氨酸、S-腺苷甲硫氨酸)，而L-甲硫氨酸已經廣泛應用于食品、醫藥、動物飼料等領域。因為L-甲硫氨酸的生物合成受到很強的調控，工業合成方式主要是酶轉化法與化學合成的結合。對于酶轉化法，O-乙酰-L-高絲氨酸可以作為前體，與甲硫醇通過酶轉化形成L-甲硫氨酸；對于化學合成法，L-高絲氨酸可以作為前體，先通過HCl的活化，然后再與甲硫醇通過化學合成形成L-甲硫氨酸。因此，作為一種潛在的平臺化合物，L-高絲氨酸的市場與應用將會不斷地提高。

L-天冬氨酸是L-高絲氨酸的前體，具體的途徑是：葡萄糖經過糖酵解形成丙酮酸，丙酮酸經過丙酮酸羧化酶(pyc編碼)催化形成草酰乙酸，草酰乙酸經過天冬氨酸轉氨酶(aspB編碼)催化形成L-天冬氨酸，L-天冬氨酸經過L-天冬氨酸激酶(lysC編碼)催化形成L-天冬氨酸-4-磷酸，L-天冬氨酸-4-磷酸經過L-天冬氨酸半醛脫氫酶(asd編碼)催化形成L-天冬氨酸半醛，L-天冬氨酸半醛經過L-高絲氨酸脫氫酶(hom編碼)催化形成L-高絲氨酸。在谷氨酸棒桿菌中進行L-賴氨酸的生產時，丙酮酸羧化酶受L-天冬氨酸的反饋抑制(BeckerJ等From zero to hero-Design-based systems metabolic engineering ofCorynebacterium glutamicum for L-lysine production，公開日2011年)；在谷氨酸棒桿菌中進行L-蛋氨酸的生產時，L-天冬氨酸激酶受L-賴氨酸和L-蘇氨酸的協同反饋抑制(李瑩，基于代謝工程選育谷氨酸棒桿菌L-蛋氨酸高產菌，公開日2016年)。雖然谷氨酸棒桿菌是生產氨基酸的主要菌株之一，但是目前還沒有相關利用谷氨酸棒桿菌生產L-高絲氨酸的報道，目前主要采用大腸桿菌為生產菌株，但以大腸桿菌作為宿主生產L-高絲氨酸會伴隨有大量的乙酸生成(Li et al.,Metabolic engineering of Escherichia coli W3110for L-homoserine production.Process Biochemistry，公開日2016年)。

而谷氨酸棒桿菌是一種安全的工業微生物，并且能夠使用更加廉價的培養基作為原料。因此，谷氨酸棒桿菌展現出很大的潛力用于生產L-高絲氨酸及其衍生物。

發明內容

為了解決上述問題，本發明構建一株重組菌，從而使得谷氨酸棒桿菌利用葡萄糖為原料進行L-高絲氨酸的生產。

本發明的第一個目的是提供一株谷氨酸棒桿菌，其特征在于，表達天冬氨酸激酶編碼基因、丙酮酸羧化酶編碼基因以及來源于大腸桿菌的天冬氨酸激酶I編碼基因。

在本發明的一種實施方式中，所述天冬氨酸激酶I編碼基因的核苷酸序列如GeneID：945803所示。

在本發明的一種實施方式中，以谷氨酸棒桿菌ATCC 13032為出發菌株。

本發明的第二個目的是提供一種產谷氨酸棒桿菌工程菌，所述工程菌以谷氨酸棒桿菌為出發菌株。