[發明專利]一種咽拭子樣本中病原體核酸提取試劑盒及提取方法

在審

• 申請號: 202010438066.4
• 申請日: 2020-05-21
• 公開（公告）號: CN111534510A
• 公開（公告）日: 2020-08-14
• 發明（設計）人: 肖理慧;孫鳳娟;王慶專
• 申請（專利權）人: 上海領駿生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 深圳靈頓知識產權代理事務所(普通合伙) 44558
• 代理人: 陶品德

本發明公開了一種咽拭子樣本中病原體核酸提取試劑盒及提取方法，具體涉及核酸提取技術領域，所述試劑盒包括蛋白酶處理液、裂解液、納米磁珠、洗滌液和洗脫液；提取方法為：利用生理鹽水和蛋白酶處理液處理離心的樣本；加入裂解液、異丙醇和納米磁珠震蕩后靜置；采用納米磁珠多次吸附核酸；最后干燥、水浴洗脫即得病原體核酸。本發明提取純化步驟簡單、操作過程安全便捷、病原體核酸含量高，純度高，通過簡單的操作步驟得到高純度、高濃度的病原體核酸，方便研究人員進行后續的檢測。

技術領域

本發明實施例涉及核酸提取技術領域，具體涉及一種咽拭子樣本中病原體核酸提取試劑盒及提取方法。

背景技術

口腔由于呼吸和進食，會存留大量種類繁多的細菌。正常人咽峽部培養應有口腔正常菌群，而無致病菌生長。但在機體全身或局部抵抗力下降和其他外部因素下可以出現感染等而導致疾病，如呼吸道感染、流感等。因此，咽拭子分泌物中病原體(細菌、病毒、衣原體等)的檢測，是臨床上重要的診斷手段。

目前病原體核酸提取純化的方法有很多種，如離心柱法和磁珠法。這些方法各有優缺點，但都應考慮以下原則：將蛋白質、脂類、糖類等物質分離干凈；排除有機溶劑和金屬離子的污染。基于納米磁珠的提取技術是利用親水性納米磁珠特異性地吸附樣品溶液中的核酸，在外加磁場的作用將吸附的核酸-磁珠復合物從樣品溶液中分離，通過洗滌液洗滌去除溶液中的蛋白和鹽離子，最后在僅留有特異吸附核酸的磁珠中加入洗脫液，將核酸釋放于洗脫液中。磁珠法提取病原體核酸與離心柱法相比，操作簡單，不易污染，已經成為目前分子生物學和臨床檢驗醫學研究的理想方法。

但是現有納米磁珠提取技術還存在以下不足：提取純化步驟較多，操作繁瑣，所得病原體核酸含量底，且純度不高，不能夠直接用于后續檢測。

發明內容

為此，本發明實施例提供一種咽拭子樣本中病原體核酸提取試劑盒及提取方法，提取純化步驟少，操作簡便，整個過程不涉及有毒試劑，安全便捷，所得病原體核酸含量高，純度高，可直接用于后續檢測，以解決現有技術中存在的問題。

為了實現上述目的，本發明實施例提供如下技術方案：一種咽拭子樣本中病原體核酸提取試劑盒，所述試劑盒包括蛋白酶處理液、裂解液、納米磁珠、洗滌液和洗脫液；

本發明還提供了一種咽拭子樣本中病原體核酸的提取方法，包括如下步驟：

步驟S1：取一新鮮咽拭子樣本于1.5ml離心管中，使用無菌移液槍頭向該離心管中加入300ul生理鹽水和10-40ul蛋白酶處理液，震蕩混勻1min， 56℃水浴靜置10min；

步驟S2：取50-200ul步驟S1中的樣本處理液于1.5ml離心管中，使用無菌移液槍頭向該離心管中加入75-300ul裂解液、75-300ul異丙醇和納米磁珠5-20ul，震蕩混勻1min，室溫靜置10min；

步驟S3：將步驟S2中的離心管置于磁力架上30s，待納米磁珠完全吸至管壁之后，使用無菌移液槍頭吸棄上清溶液；

步驟S4：使用無菌移液槍頭向步驟S3離心管中加入300-800ul洗滌液，將該離心管震蕩混勻1min，置于磁力架上30s，待納米磁珠完全吸至管壁之后，使用無菌移液槍頭吸棄上清溶液；

步驟S5：重復步驟S4一次；

步驟S6：室溫開蓋干燥5-20min直至管內無液體殘留；

步驟S7：使用無菌移液槍頭向步驟S6離心管中加入100-200ul洗脫液， 56℃水浴5-10min；

步驟S8：將步驟S7離心管震蕩混勻1min，置于磁力架上30s，待納米磁珠完全吸至管壁之后，使用無菌移液槍頭吸取上清至新的離心管，即獲得樣本中的病原體核酸。

進一步地，步驟S1中所述的蛋白酶處理液濃度為10-200mg/ml。