[發明專利]一種提高經濟作物對黃瓜花葉病毒抗性的方法

有效

• 申請號: 202010434937.5
• 申請日: 2020-05-21
• 公開（公告）號: CN111763688B
• 公開（公告）日: 2022-06-24
• 發明（設計）人: 張大偉;林宏輝;易克賢;楊峰
• 申請（專利權）人: 四川大學;中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/20;A01H6/82
• 代理公司: 成都魚爪智云知識產權代理有限公司 51308
• 代理人: 代述波

本發明公開了一種提高經濟作物對黃瓜花葉病毒抗性的方法。該方法包括以下步驟：(1)于1/2MS平板或土壤中，光照培養作物12～16h后，再暗培養作物8～10h；(2)將構建得到的過表達載體Flag?HA?WRKY30OX轉入步驟(1)培育得到的植物材料的愈傷組織中；(3)繼代2～3次后，提取總RNA，并篩選出成功轉入WRKY30OX的植株進行培養即可。本發明通過將WRKY30基因導入作物中，使其在作物中成功表達，能夠有效的提升作物對于黃瓜花葉病毒的抗病性，從而能夠對作物品種進行定向改良，具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種提高經濟作物對黃瓜花葉病毒抗性的方法。

背景技術

黃瓜花葉病毒(Cucumber Mosaic Virus，CMV)是世界范圍內流行的一種植物病毒，植株可在除生長點以外的任何部位發病。現有報道中，CMV可侵染主要經濟作物和觀賞植物1200多種。其中煙草受其危害最大，油菜和西藍花等十字花科作物亦受到較大危害。通過現代分子生物學手段，利用轉基因技術在經濟作物中的應用，培育抗病或耐病新品種是解決CMV危害的主要方式。

為了適應環境，降低細菌、真菌和病毒等各類生物脅迫對植株的損害，植物進化出了復雜的防御機制來應對。在病毒侵染過程中，植物觸發一系列細胞事件，通過幾個平行的信號轉導途徑，調節特定轉錄因子的水平，最終導致編碼合成參與病毒抗性的效應蛋白或代謝物的基因的上調或下調，從而增強對病毒的抵抗力和耐受性。

發明內容

針對現有技術中的上述不足，本發明提供一種提高經濟作物對黃瓜花葉病毒抗性的方法，可有效的提高作物對于黃瓜花葉病毒的抗性。

為實現上述目的，本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種提高經濟作物對黃瓜花葉病毒抗性的方法，包括以下步驟：

(1)于1/2MS平板或土壤中，光照培養作物12～16h后，再暗培養作物8～10h；

(2)將構建得到的過表達載體Flag-HA-WRKY30OX轉入步驟(1)培育得到的植物材料的愈傷組織中；

(3)繼代2～3次后，提取總RNA，并篩選出成功轉入WRKY30OX的植株進行培養即可。

進一步地，作物為煙草、油菜或西藍花。

進一步地，光照培養時間為16h，暗培養時間為8h。

進一步地，WRKY30基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

進一步地，步驟(3)通過RT-PCR鑒定作物中WRKY30基因的表達情況，并篩選出成功轉入WRKY30OX的植株。

進一步地，RT-PCR的反應體系包括：2μL 10×PCR Buffer、1.6μL DNTPs(2.5mM)、1.2μLL primer(100pmol/μL)、1.2μLR primer(100pmol/μL)、0.2μL TaqDNA Polymerase(3U/μL)、1μL cDNA，最后用ddH₂O補足至20μL。

進一步地，RT-PCR的反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性1min；51℃退火30s；72℃延伸30s；共30個循環，最后72℃延伸10min。

上述WRKY30基因在分子生物學輔助育種技術中的應用。

上述WRKY30基因編碼的蛋白在提高作物對黃瓜花葉病毒抗性中的應用。

本發明的技術原理為：