[發(fā)明專利]一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得整株轉(zhuǎn)基因木本植株的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010434547.8
• 申請(qǐng)日: 2020-05-20
• 公開（公告）號(hào): CN111690678B
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張世忠;劉琳;鄭成超;馬曉君
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;C12N15/29;A01H5/00
• 代理公司: 青島合創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 37264
• 代理人: 王曉曉

本發(fā)明公開了一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得整株轉(zhuǎn)基因木本植株的方法。本發(fā)明所述的方法是先將攜帶目的基因的普通或特定載體轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌中，再用活化的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液侵染預(yù)培養(yǎng)的木本植物組培苗，培養(yǎng)至植株長(zhǎng)出轉(zhuǎn)基因毛狀根后，轉(zhuǎn)至添加地塞米松或MdWUSCHEL1蛋白質(zhì)的根芽轉(zhuǎn)化預(yù)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)根生芽，再經(jīng)過擴(kuò)繁生根從而獲得整株轉(zhuǎn)基因木本植株。通過本發(fā)明的方法得到轉(zhuǎn)基因植株的轉(zhuǎn)化效率高，不僅充分利用了木本植物自身的細(xì)胞全能性，促進(jìn)轉(zhuǎn)基因根向整株轉(zhuǎn)基因植株的分化，并且成本低，該方法適用性廣，可以用于各種木本植物的轉(zhuǎn)基因培育，具有廣闊應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得整株轉(zhuǎn)基因木本植株的方法。

背景技術(shù)

利用發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物是一種傳統(tǒng)的植物轉(zhuǎn)基因方法。發(fā)根農(nóng)桿菌中含Ri質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒T-DNA的LB端含RolA、RolB、RolC、RolD四個(gè)生根相關(guān)基因，RB端含生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素和冠癭堿三個(gè)合成基因。這幾個(gè)與生根及激素相關(guān)基因的存在使發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植物后，植物在侵染成功部位長(zhǎng)出不定根，該不定根具有可離體生長(zhǎng)、生長(zhǎng)速度快、無向地性等特性。

發(fā)根農(nóng)桿菌菌株對(duì)不同植物的轉(zhuǎn)化能力不同。而現(xiàn)有發(fā)根農(nóng)桿菌成功轉(zhuǎn)化的植物多為草本植物，如玉米、花生、菠菜、人參、苜蓿、菊花、雪蓮等，且其中很多草本植物都易由轉(zhuǎn)基因根系轉(zhuǎn)化為整株轉(zhuǎn)基因植株。但對(duì)于木本植物來說，不僅轉(zhuǎn)化效率低，且轉(zhuǎn)化成功的植物種類很少，目前僅有蘋果、柑橘、喜樹、具芒小檗等幾種木本植物轉(zhuǎn)化成功，而且成功由轉(zhuǎn)基因根誘導(dǎo)為整株的也僅有柑橘。其中主要的原因的是木本植物脫分化效率較草本植物更為低下，細(xì)胞全能性差，根向芽分化難度大。

芽由頂端分生組織分化而來，而WUSCHEL1基因是頂端分生組織分化的決定性因素，它能夠促進(jìn)頂端分生組織的分化，進(jìn)而促進(jìn)芽的形成。WUSCHEL1基因也能使某些組織或器官在不添加任何外源激素的情況下誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生。雖然現(xiàn)有技術(shù)提到過通過注射帶有目的基因的發(fā)根農(nóng)桿菌的菌液的方法使已生根苗再長(zhǎng)出新的轉(zhuǎn)基因毛狀根，但該發(fā)明中最終仍停留在獲得轉(zhuǎn)基因根系的階段，并未獲得整株轉(zhuǎn)基因植株，而WUSCHEL1基因的特性對(duì)獲得整株木本植株存在重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明公開了一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得整株轉(zhuǎn)基因木本植株的方法，本發(fā)明克服了傳統(tǒng)植物轉(zhuǎn)基因方法低效率、高成本的缺陷，將WUXCHEL1基因轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)基因植物中，提高了木本植物細(xì)胞全能性，促進(jìn)轉(zhuǎn)基因根向整株轉(zhuǎn)基因植株的分化，并成功獲得含有WUXCHEL1基因的整株轉(zhuǎn)基因木本植株，提高了木本植物的轉(zhuǎn)化效率。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明提供了一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得整株轉(zhuǎn)基因木本植株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)將含有目的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌后并活化，得到含有目的基因的活化發(fā)根農(nóng)桿菌菌液；

(2)將木本植物的組培苗放入繼代培養(yǎng)基中，于25℃，16h光照/8h黑暗的條件下繼代培養(yǎng)28-32天后，切掉愈傷團(tuán)，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，于25℃，16h光照/8h黑暗的條件下預(yù)培養(yǎng)4-6天，得到預(yù)培養(yǎng)組培苗；

(3)取出所述預(yù)培養(yǎng)組培苗，切掉愈傷組織，切口處蘸取所述含有目的基因的活化發(fā)根農(nóng)桿菌菌液，然后吸干多余菌液得到侵染組培苗；

(4)將所述侵染組培苗放回生根培養(yǎng)基中，于28℃，24h黑暗的條件下培養(yǎng)1-2天后插到含有500mg/L特美汀的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直到長(zhǎng)出轉(zhuǎn)基因毛狀根，得到轉(zhuǎn)基因根系；

(5)待所述轉(zhuǎn)基因根系的根長(zhǎng)到5cm時(shí)切下，先轉(zhuǎn)入根芽轉(zhuǎn)化預(yù)培養(yǎng)基中，于25℃，16h光照/8h黑暗下培養(yǎng)5天后，再轉(zhuǎn)入添加地塞米松或MdWUSCHEL1蛋白質(zhì)的根芽轉(zhuǎn)化預(yù)培養(yǎng)基中培養(yǎng)直至生芽，得到轉(zhuǎn)基因地上部分轉(zhuǎn)基因芽；