[發明專利]一種利用發根農桿菌轉化獲得整株轉基因木本植株的方法

有效

• 申請號: 202010434547.8
• 申請日: 2020-05-20
• 公開（公告）號: CN111690678B
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發明（設計）人: 張世忠;劉琳;鄭成超;馬曉君
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/29;A01H5/00
• 代理公司: 青島合創知識產權代理事務所(普通合伙) 37264
• 代理人: 王曉曉

1.一種利用發根農桿菌轉化獲得整株轉基因木本植株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

（1）將含有目的基因的表達載體轉入發根農桿菌后并活化，得到含有目的基因的活化發根農桿菌菌液；

所述表達載體包括普通表達載體和特定表達載體，所述特定表達載體為地塞米松誘導型啟動子載體PTA7002中插入?CamV35S::WUSCHEL1-CamV35S::目的基因序列；

（2）將木本植物組的培苗放入繼代培養基中繼代培養后，切掉愈傷團，轉入生根培養基中預培養，得到預培養組培苗；所述繼代培養的時間為28-32天，預培養時間為4-6天；

（3）取出所述預培養組培苗后，切掉愈傷組織，切口處蘸取所述含有目的基因的活化發根農桿菌菌液，然后吸干多余菌液得到侵染組培苗；

（4）將所述侵染組培苗放回生根培養基中共培養，再插到含有抗生素的MS培養基中培養，直到長出轉基因毛狀根，得到轉基因根系；所述共培養時間為1-2天，培養條件為28℃，24h黑暗；

（5）待所述轉基因根系的根長到5cm時切下，先后兩次轉入根芽轉化預培養基中培養直至生芽，得到轉基因地上部分轉基因芽；第二次轉入的根芽轉化預培養基中添加地塞米松或MdWUSCHEL1蛋白質；

所述地塞米松的添加量為5-10?μm/L；所述MdWUSCHEL1蛋白質的濃度為5μM/L；

（6）將所述轉基因芽先轉入繼代培養基，再轉入生根培養基中培養至生根，得到整株轉基因木本植株；

所述木本植株包括蘋果、獼猴桃、櫻桃、桃、桂花。

2.根據權利要求1所述的利用發根農桿菌轉化獲得整株轉基因木本植株的方法，其特征在于，所述步驟（2）中生根培養基為每升MS液體培養基中含0-0.7mg/L?IBA、0-0.1mg/LIAA、200mM/L?cPTIO、20-25g/L蔗糖和8.5g/L瓊脂，pH為5.80-5.85。

3.根據權利要求1所述的利用發根農桿菌轉化獲得整株轉基因木本植株的方法，其特征在于，所述根芽轉化預培養基為MS液體培養基中含0-1.0mg/L?TDZ、0-1.0mg/L?NAA、500mg/L特美汀、30g/L蔗糖和8.5g/L瓊脂，pH為5.80-5.85。