[發明專利]外周血外泌體中Notch3蛋白作為分子標記的應用及一種檢測試劑盒

在審

• 申請號: 202010434223.4
• 申請日: 2020-05-21
• 公開（公告）號: CN111521826A
• 公開（公告）日: 2020-08-11
• 發明（設計）人: 江海松;胡建容;王偌
• 申請（專利權）人: 江海松
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 上海海貝律師事務所 31301
• 代理人: 范海燕

本發明提供一種外周血外泌體中Notch3蛋白作為分子標記在制備遺傳性腦血管疾病檢測試劑盒中的應用及一種檢測遺傳性腦血管疾病的試劑盒。本發明研究發現人外周血提取的外泌體中Notch 3蛋白在遺傳性腦血管疾病患者中顯著降低。所以，外周血外泌體中Notch 3蛋白可單獨或聯合其他指標作為診斷遺傳性腦血管疾病標記物，也可用于判斷遺傳性腦血管疾病患者的康復進程及康復后的復發風險。

技術領域

本發明涉及生物醫藥，具體涉及外周血外泌體中Notch3蛋白作為分子標記在制備遺傳性腦血管疾病檢測試劑盒中的應用及一種檢測遺傳性腦血管疾病的試劑盒。

背景技術

CADASIL(cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcorticalinfarcts and leukoencephalopathy)即是常染色體顯性遺傳病合并皮質下梗死和白質腦病。伴有皮質下梗死和白質腦病的常染色體顯性遺傳性腦動脈病，是一種遺傳性小動脈疾病，位于19號染色體上的Notch3基因突變所致的遺傳性腦小血管疾病，表現為皮質下缺血事件，并導致進行性癡呆伴假性球麻痹。

CADASIL基因位于著絲點區域D19S253,端粒區域位于D19S929。CADASIL缺陷基因為Notch 3基因。CADASIL患者90％發生錯義突變,無突變占10％共有10種不同錯義突變類型。所有突變導致半胱氨酸堿基數目發生變化。Notch 3基因突變的檢測為CADASIL的診斷提供了全新的方法。但現有的Notch 3基因突變檢測費用高、周期長，尋找價格低、周期短能早期診斷的CADASIL的新方法就顯得格外重要。

神經來源外泌體有其獨特的神經特異表面標記物，這使得其能在循環體液中特異地檢測出來。外泌體在細胞中的作用在過去幾年認為的是細胞垃圾站，現在已經被證明是重要的細胞間信號分子，以及健康和疾病的重要貢獻者。細胞膜內陷形成小的細胞內小泡，逐漸成熟融合形成多泡體，多泡體向內出芽形成腔內小泡。多泡體與溶酶體融合導致其內容物的裂解，與細胞膜融合導致外泌體被釋放到細胞外空間。因為外泌體可以自由地穿過血腦屏障，神經元來源的外泌體可以直接反映大腦環境的變化。外泌體內容物包括核酸，蛋白質和脂質，在疾病狀態下會發生變化，而且他們的膜可以保護其內容物不被降解。他們可以傳播病理性蛋白質，也可以被濃縮來提高檢測的敏感性。這些特征使得外泌體成為一個有價值的診斷工具。

發明內容

本發明的目的是提供一種外周血外泌體中Notch 3蛋白作為分子標記在制備遺傳性腦血管疾病檢測試劑盒中的應用，此為本發明的第一個發面。

作為本發明的第二個方面，本發明還提供了一種遺傳性腦血管疾病檢測試劑盒，包括提取外周血外泌體的試劑以及檢測Notch 3蛋白的抗體。

作為本發明的第三個方面，還提供了上述試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

S1：取待檢測對象的外周血樣品并提取其中的外泌體；

S2：提取外泌體中蛋白并利用檢測Notch 3蛋白的抗體對Notch 3蛋白定量；

S3：根據定量結果與正常樣本中Notch 3蛋白的量進行比較，得出待檢測對象遺傳性腦血管疾病進展程度。

進一步的，所述步驟S1具體包括：

收集待檢測對象血液于EDTA抗凝管中，放置4小時后，3000×g離心1分鐘，取上層血漿于2ml無菌管中，存放于-80℃冰箱待用；

從-80℃取出血漿放在4℃中溶化，然后取出250μl血漿于無菌管中，3000×g離心15min去除細胞和細胞碎片，轉移上清液于無菌管中，加入63μlExoQuick外泌體沉淀劑，通過顛倒，輕彈管壁混勻，放置于4℃冰箱里30min，然后1500×g離心30min，去除上清液，然后將剩余的液體重新1500×g離心5min，吸去管里所有液體，得外泌體。