[發(fā)明專利]一種人類精子冷凍保存方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010434098.7
• 申請日: 2020-05-21
• 公開（公告）號: CN111436421A
• 公開（公告）日: 2020-07-24
• 發(fā)明（設計）人: 胡煥煥;姬國杰;石曉衛(wèi);劉瑞;李明文;張靖;張晗;王朋博;秦冰鑫;蘭慶凱;沈宇杰
• 申請（專利權）人: 新鄉(xiāng)醫(yī)學院三全學院
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 西安銘澤知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 俞曉明

本發(fā)明公開了一種人類精子冷凍保存方法，包括以下步驟：S1、將精液液化，得到液化精液；S2、將S1得到的液化精液洗滌，離心，重復上述操作2～4次，然后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，得到精子樣品；S3、將S2得到的精子樣品與海藻糖溶液混勻，得到混合液；S4、將S3得到的混合液與添加劑混合均勻，接著在CO₂培養(yǎng)箱中平衡，然后裝入冷凍管中，浸入液氮中進行玻璃化冷凍保存。本發(fā)明通過在精子冷凍保存過程中加入海藻糖溶液和L?還原型谷胱甘肽溶液，增強冷凍后精子的復蘇率和前向運動百分率，降低氧DNA損傷，改善了凍后精液的質(zhì)量。

技術領域

本發(fā)明屬于精子保存技術領域，具體涉及一種精子冷凍保存方法。

背景技術

隨著現(xiàn)代文明進步與社會工業(yè)化發(fā)展，環(huán)境污染愈加嚴重，精液異常增多，導致不育癥的發(fā)病率已達到10％，成為常見疾病。精子冷凍保存技術一直是保持生育能力和輔助生殖的重要手段。盡管在這一領域已經(jīng)取得了廣泛的進展，但精子在冷凍保存后活力和DNA完整性都有所降低。人類精子低溫損傷的機制與冷休克、滲透脅迫、細胞內(nèi)成冰和氧化應激有關。低溫保存過程中產(chǎn)生的過量活性氧(ROS)通過膜脂過氧化、蛋白巰基氧化等機制影響精子的活力和受精能力。氧化應激還可引起精子核基因組DNA斷裂。氧化應激是由促氧化劑和抗氧化劑之間的不平衡引起的，在這種不平衡中，促氧化劑占優(yōu)勢。因此，如何降低冷凍對精子的損傷，是精子冷凍技術中難以突破的瓶頸。

研究表明，抗氧化劑槲皮素、維生素E、褪黑激素、還原性谷胱甘肽(GSH)等有助于改善小鼠慢速冷凍和快速冷凍后解凍后精子的活力，然而關于使用抗氧化劑通過玻璃化冷凍保存人類精子的信息有限，且這些抗氧化劑還沒有被用于人類精子的冷凍保存技術中。因此，研究抗氧化劑在人類精子冷凍保存方法中應用來改善冷凍后精子的活性是十分必要的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種人類精子冷凍保存方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是：

一種人類精子冷凍保存方法，包括以下步驟：

S1、將精液液化，得到液化精液；

S2、將S1得到的液化精液洗滌，離心，重復上述操作2～4次，然后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，得到精子樣品；

S3、將S2得到的精子樣品與海藻糖溶液混勻，得到混合液；

所述S2得到的精子樣品與海藻糖溶液的體積比為1:1；

S4、將S3得到的混合液與添加劑混合均勻，接著在培養(yǎng)箱中平衡，然后裝入保存容器中，浸入液氮中進行玻璃化冷凍保存；所述S3得到的混合液與冷凍液的體積比為200:1；

所述添加劑由以下濃度的組分組成：

L-還原型谷胱甘肽15.365～122.92g/L、氯化鈉5.7154g/L、氯化鉀0.3496g/L、硫酸鎂0.0241g/L、磷酸二氫鉀0.0504g/L、二水合氯化鈣0.3000g/L、碳酸氫鈉2.1003g/L、葡萄糖0.5008g/L、丙酮酸鈉0.0363g/L、乳酸鈉3.9968g/L、硫酸慶大霉素0.0100g/L、人血清白蛋白5g/L，余量為超純水。

優(yōu)選的，步驟S1中，所述液化溫度為25～37℃，液化時間為30～60min。

優(yōu)選的，步驟S2中，所述S1得到的液化精液通過人輸卵管液(Human TubalFluid，HTF)進行洗滌，且所述HTF液由以下濃度的組分組成：

氯化鈉5.7154g/L、氯化鉀0.3496g/L、硫酸鎂0.0241g/L、磷酸二氫鉀0.0504g/L、二水合氯化鈣0.3000g/L、碳酸氫鈉2.1003g/L、葡萄糖0.5008g/L、丙酮酸鈉0.0363g/L、乳酸鈉3.9968g/L、硫酸慶大霉素0.0100g/L、人血清白蛋白5g/L，余量為超純水；