[發明專利]一種制備誘導多能干細胞源性心肌細胞的方法及其固定方法和應用

在審

• 申請號: 202010433334.3
• 申請日: 2020-05-21
• 公開（公告）號: CN111621468A
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發明（設計）人: 張家浩;曾雪
• 申請（專利權）人: 上海慧燈醫療科技有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 上海中外企專利代理事務所(特殊普通合伙) 31387
• 代理人: 孫旭華

本發明涉及生命科學及醫療技術領域，尤其涉及培養規則形狀的誘導多能干細胞源性心肌細胞的方法及其固定方法及應用。本發明所提供的制備誘導多能干細胞源性心肌細胞的方法，具體步驟包括縮印制備步驟和多能干細胞制備步驟。本發明的有益效果是，結合生物工程中的縮印技術以及生物化學技術，培養和人體心肌細胞相似的、成熟的、規則形狀的誘導多能干細胞源性心肌細胞，并且制造成本低、產量高，培養時間短。本發明能保持所需要的細胞形態，移植到所需的環境中進行深入實驗和研究。

技術領域

本發明涉及生命科學及醫療技術領域，尤其涉及利用生物工程的縮印技術（micropatterning）制備誘導長桿型多能干細胞源性心肌細胞的方法及其固定方法。

背景技術

多能干細胞是近年來由日本科學家山中伸彌（Shinya Yamanaka）教授于2006年研發出，是目前最接近人體本身的實驗模型。多能干細胞具有和細胞源頭一樣的基因庫，在正確的實驗環境下可以最大限度的體現遺傳疾病或基因缺陷表型。多能干細胞通過誘導培育手法可以分化出單層人源心肌細胞，進而研究病理或對有表型的遺傳性心肌病進行藥篩。

目前市面上所培育的誘導多能干細胞源性心肌細胞大致分為兩種，一種為平面（2D culture）培養細胞，另一種為三維類器官培養（3D culture）。其中，成熟多能干細胞源性心肌細胞為最接近人體的長桿型的心肌細胞形態。現有技術中所培養的誘導多能干細胞源性心肌細胞（induced Pluripotent Stem Cell derived Cardiomyocytes），缺乏有效培養規則形狀的成熟多能干細胞源性心肌細胞的方法。目前已知的手法所培養出的多能干細胞源性心肌細胞多為單層，形狀不規則的多能干細胞源性心肌細胞。即使有極少數實驗室及單位能夠將二維細胞以三維的培養手法形成規則的成熟多能干細胞源性心肌細胞，但是其制造成本高，產量低，且所需時間遠高于直接培養二維多能干細胞源性心肌細胞。發明人發現，即使能培育出成熟的多能干細胞源性心肌細胞，也存在難以在保持多能干細胞源性心肌細胞形態的前提下，將所培養的多能干細胞源性心肌細胞移植到各個不同的平臺進行不同的實驗。

同時，在無法以長桿型多能干細胞源性心肌細胞為模型在不同的實驗環境中進行實驗的情況下，我們無法有效的在實驗中獲取最接近人類心臟生理功能的數據。

由此可以看出，在現有的培養誘導多能干細胞源性心肌細胞的方法中，無論是二維培養的誘導多能干細胞源性心肌細胞，還是三維培養的誘導多能干細胞源性心肌細胞，都存在的難以解決的問題是，無法將細胞培養至成熟，達到與人體心肌細胞相似的規則形態，并且制造成本高，產量低，且所需時間長。

發明內容

為解決現有技術的缺陷和不足，本發明的目的是提供一種誘導多能干細胞源性心肌細胞的方法，以及其固定方法及應用。

為實現上述目的，本發明的技術方案如下：

本發明提供了一種制備誘導多能干細胞源性心肌細胞的方法，包括縮印制備步驟和多能干細胞制備步驟，其中：

（1）所述的縮印制備步驟，包括

S01.將所需要的細胞形態以鐳射刻在硅片上;

S02.在所述硅片表面覆蓋一層PDMS或聚二甲基硅氧烷和凝固劑的混合液,放置于65攝氏度的恒溫箱過夜或至完全凝固，取下凝固的PDMS或聚二甲基硅氧烷;

S03. 在所述取下的PDMS或聚二甲基硅氧烷表面覆蓋細胞培養基質膠;以及

S04.以覆蓋了細胞培養基質膠的PDMS或聚二甲基硅氧烷為模板，在細胞培養盤表面刻印長方形；

（2)所述的多能干細胞制備步驟，包括

S1.提取養成初期的誘導多能干細胞源性心肌細胞；