[發明專利]一種制備誘導多能干細胞源性心肌細胞的方法及其固定方法和應用

在審

• 申請號: 202010433334.3
• 申請日: 2020-05-21
• 公開（公告）號: CN111621468A
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發明（設計）人: 張家浩;曾雪
• 申請（專利權）人: 上海慧燈醫療科技有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 上海中外企專利代理事務所(特殊普通合伙) 31387
• 代理人: 孫旭華

1.一種制備誘導多能干細胞源性心肌細胞的方法，其特征在于，包括縮印制備步驟和多能干細胞制備步驟，其中：

所述的縮印制備步驟，包括

S01.將所需要的細胞形態以鐳射刻在硅片上;

S02.在所述硅片表面覆蓋一層PDMS或聚二甲基硅氧烷和凝固劑的混合液,放置于65攝氏度的恒溫箱過夜或至完全凝固，取下凝固的PDMS或聚二甲基硅氧烷;

S03. 在所述取下的PDMS或聚二甲基硅氧烷表面覆蓋細胞培養基質膠;以及

S04.以覆蓋了細胞培養基質膠的PDMS或聚二甲基硅氧烷為模板，在細胞培養盤表面刻印長方形；

（2)所述的多能干細胞制備步驟，包括

S1.提取養成初期的誘導多能干細胞源性心肌細胞；

S2.將養成初期的誘導多能干細胞源性心肌細胞種植于所述表面刻印長方形的細胞培養盤中；

S3.培養三至五日，至誘導多能干細胞源性心肌細胞成長為所需要的形態并恢復跳動，

由此得到誘導多能干細胞源性心肌細胞。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的所需要的細胞形態為長桿型。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PDMS或聚二甲基硅氧烷和凝固劑的混合液為1:5至1:20的PDMS原液兌凝固液；

優選的，所述的PDMS或聚二甲基硅氧烷和凝固劑的混合液優選為1:10的PDMS原液兌凝固液。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的細胞培養基質膠由基質膠和含氨基酸及葡萄糖的培養基組成的。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的基質膠為Matrigel或小鼠內瘤基底膜基質，層粘連蛋白，明膠或纖連蛋白；

優選的，所述的基質膠為Matrigel或小鼠內瘤基底膜基質。

6.根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述的含氨基酸及葡萄糖的培養基優選為DMEM培養基。

7.根據權利要求4-6任一項所述的方法，其特征在于，所述的基質膠和含氨基酸及葡萄糖的培養基組成比濃度為1:1~400；

優選的，所述的基質膠和含氨基酸及葡萄糖的培養基組成比濃度為1:1~100；

更優選的，所述的基質膠和含氨基酸及葡萄糖的培養基組成比濃度為1:1~10；

最優選的，所述基質膠和含氨基酸及葡萄糖的培養基組成比濃度為1:10。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在所述細胞培養盤表面刻印1.0乘以7.0微米的長方形。

9.一種漲縮細胞的固定方法，其特征在于，將所述漲縮細胞在含有BDM或2,3-丁二酮單肟的試劑中，常溫浸泡三至五分鐘；

優選的，所述漲縮細胞為心肌細胞或骨肌細胞。

10.根據權利要求9所述的固定方法，其特征在于，所述漲縮細胞為權利要求1至8任一項所制備的誘導多能干細胞源性心肌細胞。

11.根據權利要求9或10所述的固定方法，其特征在于，所述的BDM或2,3-丁二酮單肟為含有5.0%以下的BDM或2,3-丁二酮單肟試劑；

優選的，所述的BDM或2,3-丁二酮單肟優選為含有0.1%的BDM或2,3-丁二酮單肟試劑。

12.根據權利要求9或10所述的固定方法，其特征在于，還包括提取步驟，所述的提取步驟包括使用1:9的穩定型胰蛋白酶替代酶或10XTrypLE和干細胞級細胞消化液或Accutase混合液消化所固定的細胞表面粘黏的細胞培養基質膠后，提取所述固定的細胞。

13.如權利要求1-8任一項所述的制備方法或10-12任一項所述的固定方法的應用，用于將所述的誘導多能干細胞源性心肌細胞移植到不同的環境進行培養。