[發明專利]菊葉薯蕷轉基因毛狀根誘導方法

有效

• 申請號: 202010431515.2
• 申請日: 2020-05-20
• 公開（公告）號: CN111778273B
• 公開（公告）日: 2022-04-29
• 發明（設計）人: 謝君;周建嬋;鐘春梅
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/06;A01H6/00
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 趙崇楊

1.一種菊葉薯蕷轉基因毛狀根誘導方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1.組培苗培養

將生根的菊葉薯蕷組培苗去掉根后轉接到繼代培養基上預培養10～20天，獲得外植體；

S2.轉基因工程菌的準備

將活化后的發根農桿菌C58C1經擴大培養后制備感受態細胞，然后轉入含目的基因的表達載體，再篩選、鑒定，得到轉基因發根農桿菌C58C1工程菌；

S3.轉基因侵染菌液的制備

將步驟S2的轉基因發根農桿菌C58C1工程菌經進行擴大培養，OD₆₀₀在0.5～0.6時，離心收集菌種，然后用含有乙酰丁香酮的1/2MS液體培養基重懸菌體，至OD₆₀₀在0.5～0.6，得到侵染菌液；

S4.侵染與共培養

將步驟S1的外植體于步驟S3的侵染菌液中侵染15～30min，侵染完畢后，移出外植體并去除外植體表面的液體，然后將外植體轉接至含有乙酰丁香酮的MS固體培養基，于23～27℃黑暗共培養2～3天；

S5.毛狀根的誘導

將外植體從共培養的培養基中取出，置于含有頭孢噻肟鈉抗生素無菌水中浸泡8～10分鐘，然后用純無菌水清洗2～4遍；待清洗完畢后將去除外植體表面的水分，然后將外植體轉接至含有頭孢噻肟鈉的MS固體培養基中培養；

S6.毛狀根的除菌培養

待外植體發根后12～16天，去掉外植體的莖、葉，將留下的毛狀根轉接到新的含頭孢噻肟鈉的MS固體培養基中，每兩周轉接一次，并且不斷降低頭孢噻肟鈉的工作濃度直到為零；

S7.毛狀根的液體擴大培養

將除菌培養后的毛狀根從外植體分離成一條一條，然后接種到1/2MS液體培養基震蕩培養；

所述繼代培養基為MS+0.05～0.3 mg/L NAA+1.2～1.7 mg/L 6-BA；

步驟S1預培養為23～27℃，光照強度1500～2500 lx，每天光照時間14～18h，培養10～20天；

步驟S3含有乙酰丁香酮的1/2MS液體培養基及步驟S4中含有乙酰丁香酮的MS固體培養基中乙酰丁香酮濃度為100～600 μmol/L；

步驟S4所述侵染為26～30℃，130～160 r/min震蕩侵染15～30min；

步驟S5所述含有頭孢噻肟鈉抗生素無菌水和含有頭孢噻肟鈉的MS固體培養中頭孢噻肟鈉濃度為200～300 mg/L；

步驟S5所述培養為于23～27℃，光照強度1500～2500 lx，每天光照時間14～18h，培養3～5天；

步驟S6第一次轉接的MS培養基中頭孢噻肟鈉的工作濃度為250 mg/L，第二次轉接的頭孢噻肟鈉工作濃度為100 mg/L，最后將材料轉接到不含Cef的MS固體培養基中。

2.根據權利要求1所述的菊葉薯蕷轉基因毛狀根誘導方法，其特征在于，還還包括轉基因毛狀根PCR檢測：提取毛狀根DNA，然后進行PCR鑒定，鑒定基因包括rol B、rol C以及轉入的目的基因。

3.根據權利要求1或2所述的菊葉薯蕷轉基因毛狀根誘導方法，其特征在于，所述目的基因為GFP。