[發明專利]菊葉薯蕷轉基因毛狀根誘導方法

有效

• 申請號: 202010431515.2
• 申請日: 2020-05-20
• 公開（公告）號: CN111778273B
• 公開（公告）日: 2022-04-29
• 發明（設計）人: 謝君;周建嬋;鐘春梅
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/06;A01H6/00
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 趙崇楊

本發明提供了一種菊葉薯蕷轉基因毛狀根誘導方法，包括組培苗培養，轉基因侵染菌液的制備，侵染與共培養，毛狀根的誘導，毛狀根的除菌培養，毛狀根的液體擴大培養。本發明提供了針對菊葉薯蕷轉基因毛狀根的誘導方法，以菊葉薯蕷去根組培苗作為外植體，發根農桿菌C58C1作為誘導菌株，在特定濃度的乙酰丁香酮條件下可高效誘導產毛狀根，誘導率可達50％～85％，同時本發明可根據需求誘導產生含不同目的基因的轉基因毛狀根。本發明對菊葉薯蕷功能基因的鑒定、薯蕷皂苷合成等生物代謝途徑的研究、分子育種、次生代謝物產業化生產等具有重要意義。

技術領域

本發明涉及植物基因工程技術領域，更具體地，涉及一種菊葉薯蕷轉基因毛狀根誘導方法。

背景技術

菊葉薯蕷(Dioscorea composita Hemsl.)為薯蕷科多年生纏繞型草本植物，原產于墨西哥，是墨西哥生產激素類藥物原料薯蕷皂苷元的主要栽培品種之一。我國于1978年首次在西雙版納熱帶植物園引種成功，其特點是薯蕷塊莖產量高，薯蕷皂苷元和淀粉含量也高，是生產薯蕷皂素和發酵生產燃料乙醇的優選原材料。但由于野生薯蕷資源被過度開采，其再生速度跟不上市場的需求，薯蕷皂苷元的產量也遠無法滿足甾體藥物工業的生產需求，供求矛盾越發突出。因此，通過優選良好的薯蕷資源，并加以研究如何提高其根狀或塊莖的產量和薯蕷皂苷元的含量，掌握薯蕷皂苷元在植物體內的消長規律，以穩定其含量等潛在著巨大的經濟效益。

發根農桿菌(Agrobacterium rhizogenes)是根瘤菌科農桿菌屬的一種侵染性很強的革蘭氏陰性土壤桿菌，能夠感染大多數雙子葉植物和少數單子葉植物以及裸子植物，在植物基因工程領域具有廣泛的應用。發根農桿菌攜帶的Ri質粒是位于發根農桿菌染色體之外獨立的雙鏈環狀DNA，包括Vir區和T-DNA區。發根農桿菌侵染植物時，植物受創傷后在傷口處產生小分子酚類化合物，從而誘導活化Ri質粒上的Vir區基因群，調控T-DNA區，將誘導發根的基因位點rol基因(rol B、rol C等)轉移到植物宿主細胞基因中，從而引起植物形態和代謝改變，導致毛狀根產生。發根農桿菌誘導植物所產生的毛狀根具有生長迅速、激素自養、生長條件簡單、次生代謝產物含量高且穩定以及分化程度高、不易變異等特點，常用來作為很多重要研究的模型。

薯蕷屬植物屬于單子葉植物，而單子葉植物不合成酚類物質，如乙酰丁香酮，很難誘導出毛狀根。根據毛狀根誘導的相關研究報道，關于單子葉植物成功誘導毛狀根的相關研究報道很少，而關于薯蕷屬植物毛狀根誘導的相關研究報道，目前也僅見于盾葉薯蕷的毛狀根誘導有初步研究(陳永勤,沈君豪,潘軍.盾葉薯蕷毛狀根的誘導與薯蕷皂甙元的生產[J].湖北大學學報(自然科學版),2009(01):79-83.)，其應用R1601、A4等發根農桿菌，以盾葉薯蕷的莖段、葉片和愈傷組織為外植體進行了毛狀根誘導，發現只有愈傷組織能夠被誘導產生毛狀根，而且誘導效率較低，為34.5％，而有關于菊葉薯蕷毛狀根誘導的相關技術目前還未見報道。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中存在的上述缺陷和不足，提供一種菊葉薯蕷轉基因毛狀根誘導方法。

本發明的上述目的是通過以下技術方案給予實現的：

一種菊葉薯蕷轉基因毛狀根誘導方法，包括如下步驟：

S1.組培苗培養

將生根的菊葉薯蕷組培苗去掉根后轉接到繼代培養基上預培養10～20天，獲得外植體；

S2.轉基因工程菌的準備

將活化后的發根農桿菌C58C1經擴大培養后制備感受態細胞，然后轉入含目的基因的表達載體，再篩選、鑒定，得到轉基因發根農桿菌C58C1工程菌；

S3.轉基因侵染菌液的制備