[發(fā)明專利]一種檢測(cè)禽呼腸孤病毒的納米PCR方法、試劑盒及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010430865.7
• 申請(qǐng)日: 2020-05-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111518956B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-06-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝芝勛;黃嬌玲;謝麗基;謝志勤;鄧顯文;羅思思;范晴;曾婷婷;張艷芳;王盛;張民秀;李孟;李小鳳;萬(wàn)麗軍;李丹;韋悠;阮志華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/686;C12R1/93
• 代理公司: 北京國(guó)謙專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11752
• 代理人: 彭淋

本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)禽呼腸孤病毒的納米PCR方法和試劑盒，納米PCR的反應(yīng)體系中添加SiOsubgt;2/subgt;/Au/Fesubgt;3/subgt;Osubgt;4/subgt;納米粒子和SEQ?ID?No.1?2所示引物，并對(duì)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。本發(fā)明采用SiOsubgt;2/subgt;/Au/Fesubgt;3/subgt;Osubgt;4/subgt;納米復(fù)合材料可以集合幾種材料的優(yōu)勢(shì)，配合使用本發(fā)明篩選的特異性引物，能夠進(jìn)一步提高PCR的靈敏性、特異性和PCR擴(kuò)增效率。

技術(shù)領(lǐng)域

本申請(qǐng)涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種檢測(cè)禽呼腸孤病毒的納米PCR方法、試劑盒及應(yīng)用。

背景技術(shù)

禽呼腸孤病毒(avian?reovirus，ARV)是呼腸孤病毒科，正呼腸孤病毒屬的成員。各種禽類包括雞、火雞、鴨、鵝及其它野鳥(niǎo)都可因感染ARV而發(fā)病，臨床病癥表現(xiàn)為病毒性關(guān)節(jié)炎、呼吸道疾病、腸道疾病、矮小綜合癥和免疫抑制等多種疾病。現(xiàn)代養(yǎng)禽業(yè)因ARV感染而引發(fā)的這些臨床病癥嚴(yán)重影響雞群健康和經(jīng)濟(jì)效益。因此，為有效防控ARV爆發(fā)流行，建立一種特異性強(qiáng)、敏感度高及快速的新型ARV檢測(cè)方法是非常必要的。

目前檢測(cè)ARV的主要方法有ELISA、RT-PCR、核酸探針、實(shí)時(shí)熒光定量PCR。雖然這些方法都具有較高的特異性和敏感性，但各有不足之處,如ELISA耗時(shí)較長(zhǎng)，RT-PCR技術(shù)復(fù)雜且電泳時(shí)需要接觸EB等有害物質(zhì)，核酸探針技術(shù)操作較繁瑣，實(shí)時(shí)熒光定量PCR所需儀器和試劑昂貴，這些不足或缺欠影響了它們的實(shí)際應(yīng)用。納米PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)的buffer中添加一定量的納米粒子顆粒，從而形成納米流體，納米流體具有很好的導(dǎo)熱性，因此在添加了納米粒子顆粒的PCR熱循環(huán)中，PCR反應(yīng)能更快的達(dá)到目標(biāo)溫度，從而縮短在非目標(biāo)溫度停留的時(shí)間，不僅減少了非特異性擴(kuò)增，同時(shí)也提高了反應(yīng)的特異性和靈敏性。因此，建立ARV納米PCR檢測(cè)方法，可以為ARV的分子流行病學(xué)調(diào)查和早期診斷提供試驗(yàn)方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種檢測(cè)禽呼腸孤病毒的納米PCR試劑盒，該試劑盒包括SiO2/Au/Fe3O4納米粒子、上游引物和下游引物；上游引物的序列為5′-AAACTCCACTGCCATCTCC-3′，如序列表中SEQ?ID?No.1所示，下游引物的序列為5′-TCGCTGTACCATCACCTCC-3′，如序列表中SEQ?ID?No.2所示。

進(jìn)一步的，該試劑盒所構(gòu)建的PCR反應(yīng)體系中所述SiO2/Au/Fe3O4納米粒子的添加量為0.5-1.5μg/25μL。上游引物和下游引物的添加量為0.4-1.2μL/25μL。

進(jìn)一步的，該試劑盒還包括MgCl2，10×PCR?buffer，dNTP，Taq酶和陽(yáng)性對(duì)照。

本發(fā)明還提供一種檢測(cè)禽呼腸孤病毒的納米PCR方法，該方法使用SEQ?ID?No.1所示的上游引物和SEQ?ID?No.2所示的下游引物擴(kuò)增禽呼腸孤病毒的特異性片段，納米PCR反應(yīng)體系中添加有SiO2/Au/Fe3O4納米粒子。

進(jìn)一步的，該納米PCR反應(yīng)體系中，上游引物和下游引物添加量為0.4-1.2μL/25μL，SiO2/Au/Fe3O4納米粒子的添加量為0.5-1.5μg/25μL，納米PCR反應(yīng)退火溫度為55℃。

進(jìn)一步的，該納米PCR反應(yīng)體系中，上游引物和下游引物添加量為0.8μL/25μL，SiO2/Au/Fe3O4納米粒子的添加量為0.5μg/25μL。

該納米PCR方法包括如下步驟：

1)提取樣品DNA或RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，獲得擴(kuò)增模板；