[發明專利]一種檢測禽呼腸孤病毒的納米PCR方法、試劑盒及應用

有效

• 申請號: 202010430865.7
• 申請日: 2020-05-20
• 公開（公告）號: CN111518956B
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 謝芝勛;黃嬌玲;謝麗基;謝志勤;鄧顯文;羅思思;范晴;曾婷婷;張艷芳;王盛;張民秀;李孟;李小鳳;萬麗軍;李丹;韋悠;阮志華
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12R1/93
• 代理公司: 北京國謙專利代理事務所(普通合伙) 11752
• 代理人: 彭淋

1.一種檢測禽呼腸孤病毒的納米PCR試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括SiO₂/Au/Fe₃O₄納米粒子、上游引物和下游引物；所述上游引物的序列為SEQ?ID?No.1所示，所述下游引物的序列為SEQ?ID?No.2所示；所述SiO₂/Au/Fe₃O₄納米粒子包括如下制備步驟：

1)1g?FeCl₃·6H₂O和0.4g?FeSO₄·7H₂O加入到10mL的去離子水中，置于300mL三頸燒瓶中室溫下攪拌30min，N₂保護條件下加熱至80℃，迅速加入100mL1.0mol/L的氨水，繼續反應40min，生成黑色懸濁液，用磁鐵分離，收集沉淀，并用二次去離子水反復洗滌五次，再用無水乙醇洗滌兩次，直到上清液變澄清，將收集的固體分散到100mL去離子水中，得到Fe₃O₄納米粒子；

2)0.229g檸檬酸鈉溶解在100mL去離子水中，磁性攪拌下加熱到80℃，再加入50mL步驟1）得到的Fe₃O₄納米粒子，然后加入20mL?10mmol/L四氯金酸，80℃下反應15min，最后移走熱源，在室溫下繼續攪拌15min；當酒紅色懸濁液冷卻至室溫后，再次用磁鐵分離；最后將收集到的固體分散到50mL去離子水中，得到的Au/Fe₃O₄懸濁液置于4℃下保持備用；

3)取50mL步驟2）得到的Au/Fe₃O₄懸濁液分散在200mL乙醇中，超聲10min，攪拌條件下，將1mL?NH₃·H₂O滴加到上述混合物中攪拌30min，加入0.027g正硅酸四乙酯，持續攪拌6h，用磁鐵分離，收集沉淀，并用二次去離子水反復洗滌五次，70℃真空干燥，稱重，最后將收集到的固體分散到去離子水中得到的1mg/mL?SiO₂/Au/Fe₃O₄懸濁液置于4℃下保持備用。

2.根據權利要求1所述的檢測禽呼腸孤病毒的納米PCR試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括MgCl₂，10×PCR?buffer，dNTP，Taq酶。

3.根據權利要求2所述的檢測禽呼腸孤病毒的納米PCR試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陽性對照。

4.一種檢測禽呼腸孤病毒的納米PCR方法，其特征在于，所述方法使用權利要求1中所述的SiO₂/Au/Fe₃O₄納米粒子、上游引物和下游引物擴增禽呼腸孤病毒的特異性片段，所述方法不包括疾病的診斷和治療方法。

5.根據權利要求4所述的檢測禽呼腸孤病毒的納米PCR方法，其特征在于，所述納米PCR的反應體系中，所述上游引物和下游引物添加量為0.4-1.2μL/25μL，和/或所述SiO₂/Au/Fe₃O₄納米粒子的添加量為0.5-1.5μg/25μL，和/或所述納米PCR反應退火溫度為55℃。

6.根據權利要求5所述的檢測禽呼腸孤病毒的納米PCR方法，其特征在于，所述納米PCR反應體系中，所述上游引物和下游引物添加量為0.8μL/25μL，和/或所述SiO₂/Au/Fe₃O₄納米粒子的添加量為0.5μg/25μL。