[發明專利]一種基于UPLC/HRMS的代謝組學相對定量分析方法

有效

• 申請號: 202010429597.7
• 申請日: 2020-05-20
• 公開（公告）號: CN111579665B
• 公開（公告）日: 2021-11-05
• 發明（設計）人: 徐英;任建洪;謝桂綱;戴貞麗;顧夢南;谷從順
• 申請（專利權）人: 蘇州帕諾米克生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/86
• 代理公司: 北京林達劉知識產權代理事務所(普通合伙) 11277
• 代理人: 劉新宇;李茂家

本發明屬于代謝組學技術領域，涉及一種基于UPLC/HRMS的代謝組學相對定量分析方法。具體而言，該方法主要包括同位素內標混合溶液、標準曲線校正溶液和代謝組學樣本溶液的配制，獲取標準曲線校正溶液和代謝組學樣本溶液的原始質譜數據，對原始數據進行轉置和解卷積，鑒定并選擇最優同位素內標，擬合線性方程并計算代謝組學樣本溶液中代謝物的相對定量結果，完成代謝組學樣本溶液中代謝物和差異代謝物的結構鑒定等步驟。該方法僅用高分辨質譜平臺即可滿足定性和定量的雙重需求，定量結果準確，定性結果準確率較高，成本較低，操作簡便，適用性廣。

技術領域

本發明屬于代謝組學技術領域，涉及一種基于UPLC/HRMS的、利用同位素內標的、用于相對定量檢測小分子代謝物的方法。

背景技術

代謝組學(Metabolomics)研究生物體系受外源性物質刺激、環境變化或遺傳修飾等因素影響后產生的所有代謝應答，并檢測代謝應答的全貌及其動態變化，研究對象一般為相對分子質量小于1000的小分子代謝物，以高通量、大規模實驗方法結合模式識別、專家系統等計算體系為特征，對生物體內所有代謝物進行定性定量分析，是系統生物學的重要組成部分。

根據研究目的不同，代謝組學可以分為四個層次：代謝物靶標分析(metabolitetarget analysis)、代謝輪廓分析(metabolic profiling analysis)、代謝指紋分析(metabolic fingerprint analysis)和代謝組學研究(metabonomics)，其中代謝物靶標分析和代謝輪廓分析用于定量檢測某個或某類特征性代謝物，代謝指紋分析用于定性或半定量分析全部代謝物，代謝組學研究則用于定量分析全部代謝物，但最后一個層次目前尚未能實現。

鑒于代謝組學的研究方法主要是對代謝物進行定性定量分析，其檢測手段則以化學分析領域當下的主流技術為主，包括核磁共振(NMR)、質譜(MS)、高效液相色譜(HPLC)、超高效液相色譜(UPLC)等。核磁檢測技術的優點是樣品無需繁瑣的前處理，可以實現樣品無創性和代謝物種類無偏向性檢測，而缺點是相比于質譜檢測技術的靈敏度較低，動態范圍有限，對含量較低或濃度相差較大的物質難以同時測定；另外，核磁檢測技術目前偏向于定性研究，適合于鑒定未知代謝物。而質譜檢測技術則具有較高的檢測靈敏度，與色譜技術聯用后更可以將復雜樣本中的代謝物先進行色譜分離再進行質譜檢測，減少了基質的干擾，有利于痕量代謝物的檢測。

質譜檢測技術依賴于代謝物在離子源中發生電離后生成的不同質荷比的帶電荷離子，在質量分析器中實現分離和聚焦，從而獲得質譜圖。根據聯用的色譜儀器不同，色譜質譜聯用技術可以分為氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)、液相色譜-質譜聯用(LC-MS)和毛細管電泳-質譜聯用(CE-MS)等。氣相色譜-質譜聯用技術適合于分析極性小、易揮發和熱穩定性較好的代謝物，針對揮發性較低的代謝物需要衍生化預處理，而衍生化過程受水分因素影響較大，且很難反映代謝物在生物樣本中真實情況。液相色譜-質譜聯用技術適合于分析中等或大極性、中低揮發性或非揮發性和熱穩定性較差的代謝物。而根據質譜檢測器不同，又可以分為四極桿檢測器(單四極桿和三重四極桿)和高分辨率檢測器(飛行時間/TOF、軌道離子阱/Orbitrap和傅里葉變換離子回旋共振/FTICR)，其中四極桿質譜適合代謝物的定量檢測，高分辨率質譜適合代謝物的定性分析。由于質譜檢測技術對于代謝物的化學性質具有明顯的偏向性，因此難以利用單獨一種檢測手段來同時完成定性和定量，需要多平臺互補分析才能較為全面地考察代謝物的變化概況。

由于存在上述技術缺陷，目前只能圍繞某單一平臺開展定性或定量代謝組學檢測方法。例如應用GC-MS平臺來檢測生物樣本中的脂肪酸等，利用LC-MS/MS平臺來開發靶向代謝物(包括膽汁酸、氨基酸和神經遞質等)檢測方法，采用高分辨質譜平臺來鑒別代謝物的結構。因此，對生物樣品中的代謝物進行全面、高通量、高靈敏度的同時定性定量分析仍是代謝組學研究亟需攻克的難點。