[發明專利]一種用于結直腸癌檢測的DNA甲基化試劑盒及使用方法、應用

在審

• 申請號: 202010428888.4
• 申請日: 2020-05-20
• 公開（公告）號: CN111560435A
• 公開（公告）日: 2020-08-21
• 發明（設計）人: 王志強;萬季;蔡雪兒;羅海燕;王一杏;夏迪;汪健;金泰慶;余濤;關建洪;王奕;宋麒
• 申請（專利權）人: 深圳市新合生物醫療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6827;C12N15/11
• 代理公司: 北京冠和權律師事務所 11399
• 代理人: 朱健

本發明公開了一種用于結直腸癌檢測的DNA甲基化試劑盒及其使用方法、應用。該試劑盒包括檢測或測量受試樣品DNA中一種或多種特定基因的甲基化狀態或水平的特異性引物和探針，所述特定基因為SEPT9、NDRG4和ACTB。本發明試劑盒能夠顯著提高早期結直腸癌的陽性檢出率和特異性(真實陰性率)，可將生物標記物的檢測靈敏度提高到皮克/納克級DNA分子。

技術領域

本發明屬于生物技術和DNA檢測技術領域，尤其涉及一種用于結直腸癌檢測的DNA甲基化試劑盒及其使用方法、應用，具體而言，涉及一種利用血漿游離DNA進行甲基化qPCR以確定一個目標基因靶點的甲基化狀態來用于結直腸癌檢測或篩查的試劑盒及其使用方法。

背景技術

結直腸癌(CRC)是全世界第三大常見癌癥，每年有600,000人死亡。對于CRC，早期識別和早期干預是降低死亡率的最佳方法。目前的篩查方法是結腸鏡檢查和大便隱血和免疫組織化學檢測(gFOBT/FIT)。由于結腸鏡檢查的不適以及對腸道制品的厭惡，這些篩查方法并未充分使用。因此，使用可靠的非侵入性血液基礎檢測來評估CRC風險對于早期發現CRC可能是有價值的。

液體活檢是用檢測分子生物標志物來替代傳統組織活檢的非侵入性方法，其用于分析的生物樣品(如DNA)可以從血液、尿液、唾液、痰液或組織樣本中獲得。與傳統的癌癥診斷方法相比，液體活檢具有以下優勢：

1.易取得，液體活檢樣本可從尿液、唾液和胸腔積液中獲得；

2.比傳統的腫瘤活組織檢查更少侵入性；

3.能取樣所有可能的癌細胞，而非僅局限于腫瘤活檢的某部分；

4.便于早期發現癌癥；

5.能用于監測腫瘤動態(治療前、治療間和治療后)；

6.具有能作為理想識別標靶治療因子的潛力。

壞死或凋亡的細胞釋放到血液中的DNA，被稱為循環游離DNA(circulating freeDNA，cfDNA)，然而在腫瘤患者的血液中，一部分cfDNA來自死亡的腫瘤細胞，這部分DNA就被定義為循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)，其主要是由單鏈或雙鏈DNA以及單鏈與雙鏈DNA的混合物組成，以DNA蛋白質復合物或游離DNA兩種形式存在，這些ctDNA多為大約134-144bp的DNA片段，并攜帶一定的腫瘤特征(包括異常甲基化、突變、缺少、插入、拷貝數等)。較早期的癌癥(意味著腫瘤尺寸較小且癌細胞較少)，釋放較少的游離循環腫瘤ctDNA，而其濃度更小于游離cfDNA；當腫瘤負荷增加時，患者的ctDNA水平會升高。迄今為止，ctDNA是獲得癌癥患者血液中分子腫瘤相關改變的診斷、預后、以及預測信息的最佳材料。

DNA甲基化改變是癌癥進程中最早發生的分子變化之一，且具有組織特異性，腫瘤抑制基因的高甲基化水平已被確定為抑制基因表達和促進癌細胞生長和擴增的重要機制。在結直腸癌中，SEPT9、NDRG4、MLH1和其它基因中的CpG(胞嘧啶(C)后接續鳥苷(G))的高甲基化已被認為是癌癥的生物標記之一。因此，對這些基因中的一種或多種的甲基化狀態進行分析可用于診斷結直腸癌的狀態。

ctDNA的甲基化分析可以為癌癥診斷提供了一個可行的選擇，但臨床上使用ctDNA輔助癌癥診斷和療法選擇的主要挑戰，仍在于如何開發高靈敏度的檢測方法以便在高cfDNA背景水平中區分微弱的ctDNA信號，特別是對于ctDNA濃度可能至pg/mL程度的早期診斷，對檢測方法的靈敏度和選擇性要求更高。然而，目前的檢測試劑盒由于受到DNA提取方法不佳、亞硫酸氫鹽處理量差、用于檢測甲基化DNA的引物或者探針設計不佳等定量PCR方法的限制，并不能很好地利用ctDNA甲基化基因進行結直腸癌的早期篩查和輔助診斷。