[發明專利]構建用于同時獲得血漿中游離DNA甲基化和片段化模式信息的文庫的方法

在審

• 申請號: 202010425068.X
• 申請日: 2020-05-19
• 公開（公告）號: CN111575347A
• 公開（公告）日: 2020-08-25
• 發明（設計）人: 汪小我;方歡;鐘碧溪
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869;C40B40/06;C40B50/06
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 肖陽

本發明提出了構建用于同時獲得血漿中游離DNA甲基化和片段化模式信息的文庫的方法，所述方法包括：(1)提取血漿中的游離DNA；(2)將所述游離DNA的末端連接測序接頭，以便得到連接有測序接頭的游離DNA；(3)將連接有測序接頭的游離DNA進行重亞硫酸鹽轉化處理，以便得到轉化后的游離DNA；(4)將所述轉化后的游離DNA進行擴增及純化處理，以便得到測序文庫。利用本發明的方法滿足了血漿中游離DNA低起始量的要求，能夠同時準確地獲得血漿中游離DNA甲基化和片段化模式信息，操作簡便，為整合分析和檢測奠定了基礎。

技術領域

本發明涉及生物領域。具體地，本發明涉及構建用于同時獲得血漿中游離DNA甲基化和片段化模式信息的文庫的方法。

背景技術

血漿游離DNA(cell-free DNA，cfDNA)是指血漿中游離于細胞之外的DNA分子，其來源于人體各組織器官凋亡后釋放的片段化基因組。血漿游離DNA的半衰期約為十幾分鐘到幾個小時，有潛力實時反映機體的健康與疾病信息。目前，通過檢測血漿游離DNA可無創監測癌癥病人的腫瘤發生發展、孕婦中胎兒的遺傳和發育、器官移植受體的排異情況，具有巨大的研究價值和應用前景。

血漿游離DNA攜帶了其來源細胞基因組的突變、拷貝數變異等基因組變異、DNA甲基化及片段化模式的信息。其中，突變包括DNA序列的點突變和插入缺失突變，拷貝數變異是由于染色質重排導致的大范圍變異，DNA甲基化一般發生于胞嘧啶的5號碳原子上，即5mC甲基化，片段化模式是指基因組被打斷為長度不一的DNA片段時產生的片段端點模式。

測序文庫構建是DNA測序前的重要步驟，主要目的是在DNA片段兩端連接預定接頭序列，便于后續測序。文庫構建的質量直接決定了數據的有效率等。

在利用血漿游離DNA進行檢測的過程中，常常需要綜合利用多維度信息，但目前DNA甲基化、片段化模式的檢測文庫需要分別構建，不僅費時費力，而且成本較高，尚缺乏同時檢測血漿游離DNA甲基化和片段化模式的文庫構建方法。

發明內容

本發明旨在至少在一定程度上解決現有技術中存在的技術問題至少之一。為此，本發明提出了構建用于同時獲得血漿中游離DNA甲基化和片段化模式信息的文庫的方法、測序文庫、同時獲得血漿中游離DNA甲基化和片段化模式信息的方法，利用該方法滿足了血漿中游離DNA低起始量的要求，能夠同時準確地獲得血漿中游離DNA甲基化和片段化模式信息，操作簡便，為整合分析和檢測奠定了基礎。

需要說明的是，本發明是基于發明人的下列發現而完成的：

血漿游離DNA測序文庫構建的一般方法為：在純化的血漿游離DNA分子兩端連接接頭序列，然后PCR擴增形成測序文庫。該建庫測序方法被稱為全基因組測序(whole genomesequencing，WGS)，所得測序數據可用于檢測基因組變異和片段化模式，不能用于檢測DNA甲基化。

目前，常見的檢測DNA甲基化信息是先用重亞硫酸鹽對DNA進行轉化，在此過程中未被甲基化保護的胞嘧啶(C)會轉化為尿嘧啶(U)，經PCR擴增后測序為胸腺嘧啶(T)，然后在DNA的兩端連接測序接頭，最后PCR擴增測序。但是，發明人發現，由于DNA可能在重亞硫酸鹽的處理下被打斷，人為打斷的DNA干擾了對DNA原始的片段化模式信息的確認，容易導致檢測結果不準確。