[發明專利]構建用于同時獲得血漿中游離DNA甲基化和片段化模式信息的文庫的方法

在審

• 申請號: 202010425068.X
• 申請日: 2020-05-19
• 公開（公告）號: CN111575347A
• 公開（公告）日: 2020-08-25
• 發明（設計）人: 汪小我;方歡;鐘碧溪
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869;C40B40/06;C40B50/06
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 肖陽

1.一種構建用于同時獲得血漿中游離DNA甲基化和片段化模式信息的文庫的方法，其特征在于，包括：

(1)提取血漿中的游離DNA；

(2)將所述游離DNA的末端連接測序接頭，以便得到連接有測序接頭的游離DNA；

(3)將所述連接有測序接頭的游離DNA進行重亞硫酸鹽轉化處理，以便得到轉化后的游離DNA；

(4)將所述轉化后的游離DNA進行擴增及純化處理，以便得到測序文庫。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述重亞硫酸鹽轉化處理是采用EZ DNAMethylation-Gold kit試劑盒進行的，具體流程如下：

將15～25μL所述連接有測序接頭的游離DNA與100～150μL CT Conversion Reagent轉化試劑混合，然后將得到的混合液于95～100℃孵育5～15分鐘，再于60～65℃孵育2.5～3.5小時，優選3.5小時，最后經孵育后的混合液進行柱層析純化，以便得到所述轉化后的游離DNA。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)進一步包括：

將所述游離DNA與終濃度為0.5～5體積％的預先經超打斷的λ-DNA進行混合，再進行末端修復、片段末端加dA準備連接，然后連接測序接頭。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，測序接頭在連接體系中的濃度為10～20μM。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述測序接頭中所有胞嘧啶攜帶甲基化修飾，且上游引物的5’端攜帶磷酸基團。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述測序接頭具有SEQ ID NO：1和2所示的核苷酸序列，其中，C端攜帶甲基化修飾。

7.一種測序文庫，其特征在于，是通過權利要求1～6任一項所述構建用于同時獲得血漿中游離DNA甲基化和片段化模式信息的文庫的方法所得到的。

8.一種同時獲得血漿中游離DNA甲基化和片段化模式信息的方法，其特征在于，包括：

對權利要求7所述測序文庫進行測序，以便得到測序數據；

對所述測序數據進行分析，以便于獲得血漿中游離DNA甲基化和片段化模式信息。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述分析包括：

將所述測序數據使用fastqc進行初步質控；再使用cutadapt去除片段末端的接頭序列，設置的-m參數為15，-O參數為1，-q參數為20；最后，使用bismark將數據比對到基因組上并去重，具體命令為bismark-N 1和deduplicate_bismark，以便得到中間文件數據；

基于所述中間文件數據，以便獲得甲基化信息和片段化模式信息。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述分析進一步包括：

合并所述中間文件數據中每條cfDNA的雙端測序讀段上的甲基化信息，刪除雙端測序讀段的重復部分的數據，然后基于一段基因組區域統計各CpG位點的cfDNA片段數和甲基化片段數，得到區域甲基化程度；

對所述中間文件數據中的所有測序片段進行統計，得到全基因組的片段長度分布；

將除性染色體以外的基因組劃分為1M長的相鄰不重疊區域，并排除基因組的黑名單區域，統計區域內短片段數和長片段數，確定區域內的短片段比例。