[發明專利]一種腫瘤特異性T細胞的分離培養方法及由其獲得的產品

有效

• 申請號: 202010424706.6
• 申請日: 2020-05-19
• 公開（公告）號: CN111961648B
• 公開（公告）日: 2022-03-29
• 發明（設計）人: 李鐵鵬;高全立;王瑤;呂璐璐
• 申請（專利權）人: 河南省腫瘤醫院
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 北京精金石知識產權代理有限公司 11470
• 代理人: 尉月麗

本發明涉及一種腫瘤特異性T細胞的分離培養方法及由其獲得的產品，所述分離培養方法為：首先對腫瘤患者的外周血進行預處理，再分離外周血中的單個核細胞，然后分離PD?1陽性的單個核細胞，最后對PD?1陽性的單個核細胞進行擴增，得到所述腫瘤特異性T細胞。本發明所涉及的分離培養腫瘤特異性T細胞的方法初始材料為腫瘤患者的外周血，無需使用患者的腫瘤組織或惡性胸腹水作為材料，取材更便捷，幾乎所有的腫瘤患者均可方便采血，且無較大創傷；最終獲得的T細胞腫瘤特異性高，且同時包含有CD4陽性和CD8陽性的T細胞；該方法的操作流程簡單、所需時間較短。

技術領域

本發明屬于細胞培養技術領域，具體涉及一種腫瘤特異性T細胞的分離培養方法及由其獲得的產品。

背景技術

惡性腫瘤嚴重危害人類的生命與健康，其死亡率居各種疾病之首。腫瘤現有的三大常規治療方法(即手術治療、放射治療及化學治療)在過去的幾十年里為提高腫瘤患者的生存率做出了重大貢獻，但始終無法解決腫瘤的轉移和復發問題，腫瘤患者的生存率近年來也不再有明顯提高，三大常規治療已遭遇到療效瓶頸，迫切需要尋找新的能夠突破腫瘤治療療效瓶頸的方法。

腫瘤特異性T淋巴細胞(CTL)即細胞毒性T淋巴細胞，是從抗原遞呈細胞接受了抗原信息，并經過克隆擴增的可特異性識別和殺傷抗原特異性靶細胞的效應T淋巴細胞，CTL是機體清除癌變細胞的主要機制，在抗腫瘤免疫過程中發揮著主要作用。CTL不僅能通過顆粒酶和穿孔素等物質直接殺傷腫瘤細胞，還可以通過分泌一些細胞因子如IFNγ和TNFα等間接地殺傷腫瘤細胞。隨著生物醫學的發展，腫瘤特異性T淋巴細胞治療近年來日益受到重視，顯示出良好的應用前景，多種特異性CTL誘導培養方案應運而生。腫瘤特異性CTL治療腫瘤疾病具有安全、靶向、高效的特點。

但是，腫瘤特異性CTL的誘導培養需要消耗大量的時間，且分離和培養步驟復雜，對技術的要求也很高，因此極大地限制了這項治療方法在癌癥患者身上的廣泛運用。有學者在動物試驗中發現培養體系中加入IL-2后可以擴增具有腫瘤細胞毒性的細胞，但研究發現該方法誘導細胞殺傷力不夠強，誘導特異性CTL效率低下。Rosenberg等開發的TIL技術存在細胞難以獲取的問題，也限制了其臨床應用。且目前現有技術中分離培養腫瘤特異性T細胞所需的細胞來源主要為患者自體腫瘤組織或惡性胸腹水，獲取途徑不方便，且會給患者帶來創傷。

CN107043749A公開了一種腫瘤浸潤T淋巴細胞的分離方法，該發明所提供的從實體腫瘤中分離誘導培養腫瘤浸潤T淋巴細胞的方法包括如下步驟：(1)將大小2-3mm³的腫瘤組織塊加入含有分離誘導培養液的培養孔中進行培養；所述分離誘導培養液為僅含有IL-7和IL-15的RPMI-1640完全培養基；(2)每3-4天進行一次半量換液；(3)2-3周后，去除所述腫瘤組織塊，培養孔中的細胞即為腫瘤浸潤T淋巴細胞，采用本發明方法分離得到的TIL純度高且具有更強的腫瘤細胞殺傷活性。但是該方法需要獲取患者自體腫瘤組織較為麻煩，且耗時比較長。

CN109402054A公開了一種CD4⁺記憶性T淋巴細胞的擴增培養方法，通過在培養基中同時添加一定量的細胞因子IL-2、IL-7和IL-21，并使培養過程中培養基中滅活自體血漿、細胞因子IL-2、IL-7和IL-21保持在一定的濃度范圍內，從而提升CD4⁺記憶性T淋巴細胞的擴增培養效果，提高CD4⁺記憶性T淋巴細胞的純度及功能性。該發明的擴增培養方法可很好的適用于CD4⁺記憶性T淋巴細胞的擴增培養，能夠誘導擴增出足夠所需的細胞量，滿足對該類T淋巴細胞體外擴增培養的需求。但該方法只能獲取到CD4⁺T淋巴細胞。

綜上，若能開發出一種源材料獲取方式簡單廣泛、操作便捷、所需時間較短的腫瘤特異性T細胞的分離培養方法是非常有意義的。

發明內容