[發(fā)明專利]一種腫瘤特異性T細胞的分離培養(yǎng)方法及由其獲得的產(chǎn)品

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010424706.6
• 申請日: 2020-05-19
• 公開（公告）號: CN111961648B
• 公開（公告）日: 2022-03-29
• 發(fā)明（設計）人: 李鐵鵬;高全立;王瑤;呂璐璐
• 申請（專利權(quán)）人: 河南省腫瘤醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 北京精金石知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11470
• 代理人: 尉月麗

1.一種腫瘤特異性T細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述分離培養(yǎng)方法為：首先對腫瘤患者的外周血進行預處理，再分離外周血中的單個核細胞，然后分離PD-1陽性的單個核細胞，最后對PD-1陽性的單個核細胞進行擴增，得到所述腫瘤特異性T細胞；

所述預處理的方法為：取出腫瘤患者的外周血后在外周血中加入PD-1抗體，然后進行孵育；

所述PD-1抗體在外周血中的終濃度為0.2-0.8 μg/mL；所述孵育的溫度為0-6℃；所述孵育的時間為0.5-24 h。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的PD-1抗體在外周血中的終濃度為0.5μg /mL；所述的孵育的溫度為4℃；所述孵育的時間為0.5h。

3.如權(quán)利要求1所述的腫瘤特異性T細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述腫瘤特異性T細胞中包含CD4⁺和CD8⁺的T細胞，其比例為：1:12-4:1。

4.如權(quán)利要求1所述的腫瘤特異性T細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的腫瘤特異性T細胞中還包括NKT和NK細胞。

5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的腫瘤特異性T細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述腫瘤患者外周血包括肺癌、腎癌、腸癌、食管癌、惡性黑色素瘤或膽管癌患者的外周血。

6.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的腫瘤特異性T細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述分離腫瘤患者外周血中的單個核細胞的方法為：腫瘤患者外周血用Ficoll密度梯度法分離得到單個核細胞。

7.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的腫瘤特異性T細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述分離PD-1陽性的單個核細胞的方法為：將分離得到的單個核細胞與生物素化的抗人IgG4抗體進行一次共孵育，再加入抗生物素抗體或鏈霉親和素包被的磁珠進行二次共孵育，磁力分離得到PD-1陽性的單個核細胞；

所述一次共孵育的溫度為20-30℃；

所述一次共孵育的時間為10-30 min；

所述生物素化的抗人IgG4抗體的使用濃度為每10⁷個單個核細胞使用1-4 μg；

所述二次共孵育的溫度為20-30℃；

所述二次共孵育的時間為5-20 min。

8.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的腫瘤特異性T細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述對PD-1陽性的單個核細胞進行擴增的方法為：將分離得到的PD-1陽性的單個核細胞用無血清培養(yǎng)液重懸，種入預包被培養(yǎng)瓶進行擴增，得到擴增后的所述腫瘤特異性T細胞。

9.如權(quán)利要求8所述的腫瘤特異性T細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述預包被培養(yǎng)瓶是由重組人纖連蛋白片段和抗人CD3活化抗體進行包被的培養(yǎng)瓶；

所述纖連蛋白的終濃度為4-8 μg/mL；

所述抗人CD3抗體的終濃度為1-2 μg/mL；

所述無血清培養(yǎng)液包括白細胞介素2和蛋白激酶B抑制劑；

所述無血清培養(yǎng)液還包括白細胞介素7、白細胞介素15或白細胞介素21中的任意一種或至少兩種的組合。

10.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的腫瘤特異性T細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述分離培養(yǎng)方法具體包括如下步驟：

（1）取腫瘤患者的外周血加入PD-1抗體使其終濃度為0.2-0.8 μg/mL，在0-6℃下進行孵育0.5-24 h；

（2）將步驟（1）得到的產(chǎn)品用Ficoll密度梯度法分離得到單個核細胞；

（3）將步驟（2）分離得到的單個核細胞與濃度為每10⁷個單個核細胞2.5μg的生物素化修飾的抗人IgG4抗體在20-30℃下共孵育10-30 min，再加入抗生物素抗體或鏈霉親和素包被的磁珠在20-30℃下共孵育5-20 min，磁力分離得到PD-1陽性的單個核細胞；

（4）將步驟（3）分離得到的PD-1陽性的單個核細胞用包含有白細胞介素2、白細胞介素7、白細胞介素15、白細胞介素21和蛋白激酶B抑制劑的無血清培養(yǎng)液重懸，種入被4-8 μg/mL重組人纖連蛋白片段和1-2 μg/mL抗人CD3活化抗體處理后的預包被培養(yǎng)瓶進行擴增，得到擴增后的腫瘤特異性T細胞。