[發明專利]用于快速鑒定產嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的引物及檢測方法

在審

• 申請號: 202010424471.0
• 申請日: 2020-05-19
• 公開（公告）號: CN111690757A
• 公開（公告）日: 2020-09-22
• 發明（設計）人: 徐曉可;丁郁;李巖;馮曌;郭卉;張菊梅
• 申請（專利權）人: 廣東嶺南職業技術學院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/085
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 楊燕瑞

本發明屬于檢驗檢疫領域，特別涉及用于快速鑒定產嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的引物及其檢測方法。本發明包括上游外引物F3、下游外引物B3、上游內引物FIP和下游內引物BIP。本發明的LAMP引物是針對產嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌基因cesB設計出4條特異性引物，特異性高。本發明的LAMP檢測方法對產嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的檢測靈敏度可達到0.0124ng/25μL。應用本發明方法，可對含產嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌樣本進行快速檢測，且LAMP核酸擴增是在等溫條件下進行，不需要復雜的儀器設備和昂貴的分子試劑，結果肉眼直接可見。

技術領域

本發明屬于檢驗檢疫領域，特別涉及用于快速鑒定產嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的引物及其檢測方法。

背景技術

蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)是一種可引起食物中毒的常見食源性致病菌。食用了被蠟樣芽胞桿菌污染的食品易引發腹瀉和嘔吐，導致食物中毒，甚至會引發心內膜炎、腦膜炎和菌血癥等疾病。蠟樣芽胞桿菌可導致腹瀉型和嘔吐型兩種不同類型的食物中毒，分別由其產生的腹瀉毒素(腸毒素)和嘔吐毒素引起。據報道，當被污染的食品中蠟樣芽孢桿菌數量超過10⁵CFU/g可能導致食物中毒甚至死亡。

國外蠟樣芽胞桿菌引起的食物中毒事件頻發。1950年在挪威發表了第一起蠟樣芽胞桿菌食物中毒的報告，之后許多國家，尤其是歐洲一些國家相繼報告了類似食物中毒的爆發。蠟樣芽胞桿菌已被挪威和荷蘭認定為食品中最容易檢出的病原微生物。我國在上世紀70年代確認蠟樣芽胞桿菌中毒事件后，此類中毒事件的報道逐年增多。據2008-2015年我國國家食源性疾病監測網統計資料顯示，微生物性食源性疾病占比39％，居首位，其中蠟樣芽胞桿菌引起的中毒事件占17％，在細菌性病原體中排在第三，危害極為嚴重。在我國由蠟樣芽胞桿菌引發的食品中毒主要是由嘔吐毒素引起的(約占75％)。因此，蠟樣芽胞桿菌尤其是嘔吐型菌株的快速檢測尤為重要。

我國目前檢測蠟樣芽胞桿菌的方法是食品安全國家標準食品微生物學檢驗蠟樣芽胞桿菌檢驗(GB 4789.14—2014)。主要分為以下幾步：增菌、分離培養、鏡檢、生化鑒定、生化分型。而對于分離的蠟樣芽胞桿菌主要是采用PCR的方法鑒定其是否是嘔吐毒株(嘔吐毒素基因存在與否)。環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)作為一種新興的檢測方法，一經報道就受到各國學者的廣泛關注。LAMP方法與PCR技術相比，檢測時間短，具有更高的靈敏度和特異性，操作簡單，僅僅需要普通水浴鍋就可以完成檢測。在食源性致病菌方面，目前已經建立了副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、沙門氏菌(Salmonella spp.)和蠟樣芽胞桿菌等致病菌的LAMP技術，但沒有產嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌LAMP的報道。

發明內容

為了克服上述現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供用于快速鑒定產嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的引物。

本發明以產嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌基因cesB為靶基因，設計LAMP反應特異性引物，構建LAMP反應體系，建立一種更為特異、靈敏的快速鑒定技術，為衛生檢驗和食品質量安全提供技術保障，提高我國公共衛生控制水平。

本發明另一目的在于提供一種采用上述引物以LAMP法快速鑒定產嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的檢測方法。

本發明再一目的在于提供上述檢測方法的應用。

本發明的目的通過下述方案實現：

用于快速鑒定產嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的引物，包括上游外引物F3、下游外引物B3、上游內引物FIP和下游內引物BIP，序列如下所示：

F3：5’-CTACAACAATTTTCTGCAAAGT-3’

B3：5’-AGCCAAGTGAAGAATACCAT-3’