[發(fā)明專利]用于快速鑒定產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的引物及檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010424471.0
• 申請(qǐng)日: 2020-05-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111690757A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-09-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐曉可;丁郁;李巖;馮曌;郭卉;張菊梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東嶺南職業(yè)技術(shù)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/085
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 楊燕瑞

1.用于快速鑒定產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的引物，其特征在于包括上游外引物F3、下游外引物B3、上游內(nèi)引物FIP和下游內(nèi)引物BIP，序列如下所示：

F3：5’-CTACAACAATTTTCTGCAAAGT-3’

B3：5’-AGCCAAGTGAAGAATACCAT-3’

FIP：5’-TGTAATTCCTCTAATGACGCAAGATATTTATTGTAGGAAGAACAGCA-3’

BIP：5’-TGTTCACTATATCGATGGGGACCCTGTCCCCCAAATCTCTT-3’。

2.一種基于權(quán)利要求1所述的用于快速鑒定產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的引物的檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟：

以待檢測(cè)樣本的DNA為模板，利用上述引物進(jìn)行LAMP反應(yīng)擴(kuò)增，再通過(guò)熒光染料目測(cè)觀察法進(jìn)行檢測(cè)；

所述LAMP反應(yīng)體系為：25μL，其中F3與B3分別為0.1-0.3μmol/L，F(xiàn)IP與BIP分別為1.2-2.0μmol/L，2.5μL 1×Thermopol反應(yīng)緩沖液，1.2-2.0mmol/L dNTPs，2-10mmol/L MgSO₄，0.5-1.5mol/L甜菜堿，8U Bst DNA聚合酶，10-100ng DNA模板，不足部分用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足；LAMP反應(yīng)條件為在60-65℃孵育45-60min。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于：所述LAMP反應(yīng)體系為：25μL，其中F3與B3分別為0.2μmol/L，F(xiàn)IP與BIP分別為1.6μmol/L，2.5μL1×Thermopol反應(yīng)緩沖液，1.6mmol/L dNTPs，6mmol/L MgSO₄，1mol/L甜菜堿，8U Bst DNA聚合酶，50ng DNA模板，不足部分用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于：所述熒光染料目測(cè)觀察法：在LAMP反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1μL顯色劑，所述顯色劑為SYBR GreenⅠ，觀察結(jié)果進(jìn)行判斷；顯色結(jié)果觀察到綠色熒光判斷為陽(yáng)性，橙色判斷為陰性。

5.權(quán)利要求1所述的用于快速鑒定產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的引物在產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的檢測(cè)和鑒定中的應(yīng)用。