[發(fā)明專利]一種基于高通量測(cè)序的擬桿菌快速檢測(cè)方法及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010423475.7
• 申請(qǐng)日: 2020-05-19
• 公開（公告）號(hào): CN111534622B
• 公開（公告）日: 2021-07-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 翟齊嘯;陳衛(wèi);王晨;陸文偉;于雷雷;田豐偉;趙建新;張灝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/6869;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發(fā)明公開了一種基于高通量測(cè)序的擬桿菌快速檢測(cè)方法及應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過分子生物學(xué)方法獲取一段具有高度分辨率的核心基因片段rpsD基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，可實(shí)現(xiàn)擬桿菌的高通量鑒定，無需分離純化即可全面鑒定復(fù)雜樣品中的擬桿菌的組成，分辨率高于16S rRNA基因片段。通過基于rpsD基因的特異性引物擴(kuò)展的目的條帶約為500bp，比傳統(tǒng)鑒定方法節(jié)約50％以上的擬桿菌鑒定成本。將設(shè)計(jì)得到的引物與高通量測(cè)序結(jié)合，可以對(duì)糞便樣品中擬桿菌的分布進(jìn)行精確鑒定，并可以鑒定出現(xiàn)有報(bào)道的所有擬桿菌種，對(duì)擬桿菌種的鑒定準(zhǔn)確率達(dá)100％。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基于高通量測(cè)序的擬桿菌快速檢測(cè)方法及應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

擬桿菌是人類腸道菌群中數(shù)量最多的革蘭氏陰性細(xì)菌。作為典型的下一代益生菌之一，它編碼了許多補(bǔ)充人類基因組功能的基因。其中包括增強(qiáng)我們消化膳食纖維多糖的能力，緩解疾病，增強(qiáng)人體免疫力，甚至增強(qiáng)對(duì)癌癥的抑制，表明擬桿菌屬與宿主之間存在復(fù)雜的關(guān)系。值得注意的是，其中一些功能與人類腸道內(nèi)不同種擬桿菌的生態(tài)分布以及豐度有關(guān)。因此，開發(fā)快速檢測(cè)擬桿菌菌種的方法顯得越發(fā)重要，甚至需要鑒定至種的水平，來評(píng)估其在人體腸道中的多樣性和組成，以了解其與人體健康和疾病的關(guān)系。

近年來，隨著分子生物學(xué)方法的發(fā)展，特別是基于16S rDNA基因的新一代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，使得大量的樣品可以進(jìn)行更深入的檢測(cè)，并提出了多種檢測(cè)方法。最初，國外的一篇論文提出了一種基于16S rRNA基因、16S-23S rRNAISR和23S rRNA基因可變區(qū)核苷酸序列的兩步法多重PCR檢測(cè)方法，該方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)10個(gè)脆弱擬桿菌群的鑒定。之后，一些針對(duì)擬桿菌鑒定的技術(shù)被不斷完善，比如一些學(xué)者設(shè)計(jì)了19個(gè)寡核苷酸引物可以在不同層次(結(jié)構(gòu)域、順序、簇和種類)來檢測(cè)14種擬桿菌。盡管這些檢測(cè)方法使樣品在MiSeq儀器上的直接測(cè)序成為可能，但并沒有充分發(fā)揮測(cè)序技術(shù)的潛力。前者由于其繁瑣的步驟而受到限制，并且只能用于鑒定有限數(shù)量的10個(gè)脆弱類擬桿菌群種，數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于與人類腸道相關(guān)的28個(gè)種。而后者的敏感性可能受到復(fù)雜環(huán)境樣本中的非靶標(biāo)DNA的干擾而影響測(cè)序質(zhì)量。此外，基于16S rRNA的V3-V4區(qū)，提出了一種改進(jìn)的雙標(biāo)引擴(kuò)增和測(cè)序方法，用于評(píng)估臨床樣本微生物群落的組成。但V3-V4區(qū)域的檢測(cè)只能在屬水平上識(shí)別菌群，限制了擬桿菌屬的研究進(jìn)展。此外，根據(jù)調(diào)查，國內(nèi)尚沒有關(guān)于擬桿菌鑒定方法的專利報(bào)道。而國際上有關(guān)擬桿菌引物或者方法報(bào)道的專利只有少數(shù)幾種。例如2006年，一種基于16S-23S基因間隔區(qū)DNA片段設(shè)計(jì)引物鑒定Bacteroides forsythus的的方法(公開號(hào)：JP2004057008A)。同年，一種利用該引物快速、簡(jiǎn)便地識(shí)別和分析細(xì)菌的方法能夠識(shí)別7種不同的擬桿菌株(公開號(hào)：JP2006149400A)。但和現(xiàn)有的科研報(bào)道類似，這兩種專利方法對(duì)于擬桿菌的識(shí)別還有很大的缺陷，它們僅能識(shí)別有限的幾種擬桿菌。因此，目前還沒有一種有效的技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)所有擬桿菌在復(fù)雜樣品中種水平的快速鑒定。

發(fā)明內(nèi)容

基于此，本發(fā)明通過分子生物學(xué)方法獲取擬桿菌種的核心基因序列。在此基礎(chǔ)上，對(duì)這些核心基因進(jìn)行比對(duì)，選取一段具有高度分辨率的核心基因片段rpsD基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，并結(jié)合Illumina MiSeq高通量測(cè)序檢測(cè)技術(shù)的使用，首次開發(fā)了一種擬桿菌種的快速檢測(cè)技術(shù)。為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，本發(fā)明選取rpsD基因(在過去的報(bào)道中rpsD作為區(qū)別于16s rRNA序列的一段基因，主要參與30S核糖體蛋白S4)，以該基因?yàn)榛A(chǔ)設(shè)計(jì)引物，通過高通量測(cè)序技術(shù)在種水平進(jìn)行擬桿菌的檢測(cè)和鑒定。該方法可用于快速、靈敏和特異地檢測(cè)復(fù)雜樣品中不同種擬桿菌的組成。

本發(fā)明提供了一種鑒定擬桿菌種的方法，所述方法是以rpsD基因?yàn)闃?biāo)記物進(jìn)行鑒定。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列為引物對(duì)標(biāo)記物基因rpsD的序列進(jìn)行擴(kuò)增，能夠成功擴(kuò)增獲得目的條帶的即為擬桿菌。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述標(biāo)記物基因片段的大小為450～550bp。