[發(fā)明專利]一種基因轉(zhuǎn)錄區(qū)多變區(qū)測序方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202010419992.7
• 申請日: 2020-05-18
• 公開（公告）號: CN111662969A
• 公開（公告）日: 2020-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李佳
• 申請（專利權(quán)）人: 北京優(yōu)吉科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6806;C40B50/06
• 代理公司: 天津睿禾唯晟專利代理事務(wù)所(普通合伙) 12235
• 代理人: 李春榮

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，且公開了一種基因轉(zhuǎn)錄區(qū)多變區(qū)測序方法，包括以下步驟：步驟S1：樣品檢測；步驟S2：文庫構(gòu)建；步驟S3：mRNA的純化；步驟S4：cDNA合成；步驟S5：末端修復(fù)和接頭連接；步驟S6：目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本處理；步驟S7：配制反應(yīng)體系；步驟S8：PCR反應(yīng)及產(chǎn)物回收：配制PCR反應(yīng)體系，并設(shè)置反應(yīng)程序，對連接產(chǎn)物進行擴增；步驟S9：文庫檢測：使用檢測文庫的插入片段范圍，同時對文庫進行濃度的定量；步驟S10：精準(zhǔn)測序。本發(fā)明設(shè)計的基因轉(zhuǎn)錄區(qū)多變區(qū)測序方法通過新一代高通量測序，大幅度縮減測序數(shù)據(jù)量，能夠全面快速地獲得某一物種特定組織或器官在特定狀態(tài)下的目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本序列的頻率信息，適用不同建庫試劑盒。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基因轉(zhuǎn)錄區(qū)多變區(qū)測序方法。

背景技術(shù)

轉(zhuǎn)錄組測序的研究對象為特定細胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，主要包括mRNA和非編碼RNA。轉(zhuǎn)錄組研究是基因功能及結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)和出發(fā)點，通過新一代高通量測序，能夠全面快速地獲得某一物種特定組織或器官在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本序列信息，已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、臨床診斷和藥物研發(fā)等領(lǐng)域。轉(zhuǎn)錄組是特定組織或細胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，主要包括mRNA和非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)。轉(zhuǎn)錄組研究能夠從整體水平研究基因功能以及基因結(jié)構(gòu)，揭示特定的生物學(xué)過程，已廣應(yīng)用于植物候選基因發(fā)掘、功能鑒定及遺傳改良等領(lǐng)域。隨著新一代測序平臺的市場化，RNA測序(RNA sequenclng，RNA-Seq)技術(shù)已成為了轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的重要手段之一。

該技術(shù)利用新一代高通量測序平臺對基因組cDNA測序，通過統(tǒng)計相關(guān)Reads(用于測序的cDNA小片段)數(shù)計算出不同mRNA的表達量，分析轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)和表達水平，同時發(fā)現(xiàn)未知轉(zhuǎn)錄本和稀有轉(zhuǎn)錄本，精確地識別可變剪切位點以及編碼序列單核苷酸多態(tài)性，提供最全面的轉(zhuǎn)錄組信息。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)流程主要包括樣品制備、文庫構(gòu)建、DNA成簇擴增、高通量測序和數(shù)據(jù)分析，相對于傳統(tǒng)的芯片雜交平臺，RNA-Seq技術(shù)具有諸多獨特優(yōu)勢，轉(zhuǎn)錄組測序無需預(yù)先針對已知序列設(shè)計探針，即可對任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活動進行檢測，提供更精確的數(shù)字化信號、更高的檢測通量以及更廣泛的檢測范圍，是目前深入研究轉(zhuǎn)錄組的強大工具，因此我們提出了一種基因轉(zhuǎn)錄區(qū)多變區(qū)測序方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的缺點，而提出的一種基因轉(zhuǎn)錄區(qū)多變區(qū)測序方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

一種基因轉(zhuǎn)錄區(qū)多變區(qū)測序方法，對于目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本可以進行精準(zhǔn)定性和定量，我們根據(jù)目標(biāo)區(qū)域轉(zhuǎn)錄本的序列情況，進行引物A設(shè)計，設(shè)計好后進行實驗，包括以下步驟：

步驟S1：樣品檢測：檢測total RNA的濃度、RIN值、28S/18S和片段大小；

步驟S2：文庫構(gòu)建；

步驟S3：mRNA的純化：取一定量total RNA樣品，適溫變性打開total RNA的二級結(jié)構(gòu)，并進行純化，得到mRNA；

步驟S4：cDNA合成：向步驟S3中所述的mRNA中加入提前配制的一鏈合成反應(yīng)體系，在PCR儀上按相應(yīng)程序合成一鏈cDNA，配制二鏈合成反應(yīng)體系，適溫反應(yīng)一定時間，合成二鏈cDNA；

步驟S5：末端修復(fù)和接頭連接：配制反應(yīng)體系，適溫反應(yīng)一定時間，修復(fù)雙鏈cDNA末端，配制接頭連接反應(yīng)體系，適溫反應(yīng)一定時間，使接頭與cDNA連接；

步驟S6：目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本處理：在步驟S5中所述得到的帶有測序文庫接頭的序列進行擴增；擴增時使用我們設(shè)計的引物A和3’端測序文庫接頭進行。

步驟S7：配制反應(yīng)體系，適溫反應(yīng)一定時間，配制接頭連接反應(yīng)體系，適溫反應(yīng)一定時間，使5’端測序文庫接頭與S7中的擴增產(chǎn)物鏈接；