[發明專利]一種基因轉錄區多變區測序方法

在審

• 申請號: 202010419992.7
• 申請日: 2020-05-18
• 公開（公告）號: CN111662969A
• 公開（公告）日: 2020-09-15
• 發明（設計）人: 李佳
• 申請（專利權）人: 北京優吉科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6806;C40B50/06
• 代理公司: 天津睿禾唯晟專利代理事務所(普通合伙) 12235
• 代理人: 李春榮

1.一種基因轉錄區多變區測序方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟S1：樣品檢測：檢測total RNA的濃度、RIN值、28S/18S和片段大小；

步驟S2：文庫構建；

步驟S3：mRNA的純化：取一定量total RNA樣品，適溫變性打開total RNA的二級結構，并進行純化，得到mRNA；

步驟S4：cDNA合成：向步驟S3中所述的mRNA中加入提前配制的一鏈合成反應體系，在PCR儀上按相應程序合成一鏈cDNA，配制二鏈合成反應體系，適溫反應一定時間，合成二鏈cDNA；

步驟S5：末端修復和接頭連接：配制反應體系，適溫反應一定時間，修復雙鏈cDNA末端，配制接頭連接反應體系，適溫反應一定時間，使接頭與cDNA連接；

步驟S6：目標轉錄本處理：在步驟S5中所述得到的帶有測序文庫接頭的序列進行擴增；擴增時使用設計的引物A和3’端測序文庫接頭進行。

步驟S7：配制反應體系，適溫反應一定時間，配制接頭連接反應體系，適溫反應一定時間，使5’端測序文庫接頭與S7中的擴增產物鏈接；

步驟S8：PCR反應及產物回收：配制PCR反應體系，并設置反應程序，對連接產物進行擴增；

步驟S9：文庫檢測：使用檢測文庫的插入片段范圍，同時對文庫進行濃度的定量；

步驟S10：精準測序：富集好轉錄本多變區的大量序列，進行精準測序。

2.根據權利要求1所述的一種基因轉錄區多變區測序方法，其特征在于，所述步驟S1中，通過使用Agilent 2100Bioanalyzer檢測total RNA的濃度、RIN值、28S/18S和片段大小。

3.根據權利要求1所述的一種基因轉錄區多變區測序方法，其特征在于，所述步驟S3中，通過使用oligo-dT磁珠對total RNA進行純化。

4.根據權利要求1所述的一種基因轉錄區多變區測序方法，其特征在于，所述步驟S5中，在擴增目標轉錄本時，加入的5’端測序引物是根據物種和目標轉錄本序列特性設計合成。

5.根據權利要求1所述的一種基因轉錄區多變區測序方法，其特征在于，所述步驟S6中，修復雙鏈cDNA末端時，在3’末端加上A堿基。

6.根據權利要求1所述的一種基因轉錄區多變區測序方法，其特征在于，所述步驟S8中，檢測文庫選用Agilent 2100Bioanalyzer。

7.根據權利要求1所述的一種基因轉錄區多變區測序方法，其特征在于，所述步驟S8中，通過使用ABI StepOnePlus Real-Time PCR System對文庫進行濃度的定量。