[發明專利]利用二代測序快速開發甘藍型油菜抗草甘磷連鎖分子標記

在審

• 申請號: 202010419694.8
• 申請日: 2020-05-18
• 公開（公告）號: CN111534629A
• 公開（公告）日: 2020-08-14
• 發明（設計）人: 王瑞;陳雪;曲存民;李加納
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所(普通合伙) 11308
• 代理人: 黎昌莉

本發明公開了一種利用二代測序快速開發的甘藍型油菜抗草甘磷連鎖SSR和InDel分子標記，所述分子標記包括5個SSR引物對和4個InDel引物對。分子連鎖標記的開發，可使抗草甘磷基因在甘藍型油菜不同種質資源中的轉育更為有效快速和準確，本發明開發的抗草甘磷基因連鎖分子標記結合田間分離世代轉育抗草甘磷基因對為轉育甘藍型油菜抗草甘磷新品系是提供快捷有效的辦法。

技術領域

本發明屬于油菜育種技術領域。具體涉及一種利用二代測序組學技術快速鑒定甘藍型油菜抗草甘磷基因候選區間并開發連鎖SSR和InDel標記的方法。

背景技術

油菜是重要的油料作物，菜籽油約占中國食用植物油消費量的23％，是我國食用植物油主要來源之一。油菜地雜草危害導致油菜生產效率低、成本高，成為制約油菜生產發展重要因素。我國油菜，特別是稻田油菜因雜草危害一般田塊產量損失在10％以上，嚴重田塊則達50％以上。采用人工除草，勞動強度大，效果差；采用化學除草，只能施用選擇性除草劑，除草不徹底，同時選擇性類除草劑因分解慢，殘留多，有時危害下季作物。生產實踐中發現，草甘膦以外的除草劑都極易使雜草產生抗藥性。草甘膦(N-膦酸甲基甘氨酸)是一種內吸傳導型廣譜滅生性除草劑，通過抑制5-磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3磷酸合酶(EPSPS)的活性阻斷莽草酸路徑，使植物芳香族氨酸合成受阻(Gruys et al.,1993)，從而導致植物死亡。利用從農桿菌(AgobacteriumsP.CP4)中分離出的EPSP合成酶一CP4酶,該酶對草甘麟不敏感,對PEP具有很高的親和力,它可以取代植物內源EPSP合成酶體系,使莽草酸途徑正常進行,從而達到抗草甘嶙的效果。目前草甘磷抗性作物絕大部分含有編碼非敏感EPSP合成酶一CP4酶的轉基因(Zelaya and Owen,2005)(Zelayawen and Owen,2005)。1996年，Monsanto(孟山都)公司克隆了CP4-EPSPS基因，并轉化了大豆，獲得了最早的商業化的大豆抗草甘膦品種(Pollegioni et al.,2011)。到目前為止，許多變異版本的EPSPS基因相繼被克隆。孟山都公司在1974年推出了草甘膦異丙胺鹽將其投放市場，商品名為農達(Roundup)(Duke and Powles,2008；Funke et al.,2006)。美國農民1996～2004年間種植抗草甘膦大豆增收64億美元，種植抗草甘膦玉米增收5.64億美元；而在加拿大種植抗草甘膦油菜每公頃可增加凈收入27美元。

在抗草甘膦轉基因油菜的研究中，鐘蓉等(1997)在由農桿菌介導的油菜下胚軸、子葉的遺傳轉化中，對抗草甘膦基因進行轉化，成功獲得轉化苗。王景雪等(2005)將抗草甘膦和抗蟲基因的雙抗載體轉入湘油15號，獲得了雙抗的油菜植株。王開芳(2015)構建了含有EPSPs和BnGRF2雙價基因的植物表達載體pCEGRF，將該載體導入油菜中，可獲得抗草甘膦除草劑和高含油率高的油菜品種。萬麗麗等(2016)將PCAMBIA-GOX-CP4EPSP植物雙元表達載體轉化到甘藍型油菜PolCMS恢復系“7-5”獲得的轉基因植株。經試驗驗證該轉基因植株是具有草甘膦抗性。李杰華(2018)利用農桿菌介導的油菜下胚軸遺傳轉化方法，將抗草甘膦和抗草銨膦的基因轉入甘藍型油菜甲9707品系中，獲得了同時具有抗草甘膦和草銨膦的轉基因油菜。王朋寶等(2019)通過農桿菌介導法將構建好的抗草甘膦和磷高效吸收基因的表達載體導入甘藍型油菜中，獲得的轉基因陽性植株同時具有草甘膦的抗性和對磷素具有高效吸收的特性。目前為止，全球共有498個轉基因轉化事件，其中335個為抗除草劑轉化事件，而棉花、大豆、油菜和玉米的抗除草劑轉化事件306個，占抗除草劑轉化事件總數的91.34％。我國在轉基因油菜育種已開展廣泛研究，但由于政策對轉基因作物的限制，目前除草劑油菜品種不能推廣種植，隨著國家產業政策調整和對轉基因事件的深入認識，油菜轉基因品種的推廣和種植指日可待。因此，獲得穩定高產優質、抗滅生性除草劑草甘膦基因的油菜品系，能很好地解決油菜生產的草害問題，為我國油菜生產儲備新材料和新技術。