[發明專利]利用二代測序快速開發甘藍型油菜抗草甘磷連鎖分子標記

在審

• 申請號: 202010419694.8
• 申請日: 2020-05-18
• 公開（公告）號: CN111534629A
• 公開（公告）日: 2020-08-14
• 發明（設計）人: 王瑞;陳雪;曲存民;李加納
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所(普通合伙) 11308
• 代理人: 黎昌莉

1.甘藍型油菜抗草甘磷連鎖SSR和InDel分子標記，其特征在于，所述分子標記包括以下5個SSR引物對和4個InDel引物對中至少一對，

SSR-10F：CTTCCGCACGCATCAGAAGAAT，SSR-10R：TGCTTGCGAGTTTTCCGGTTAA，

SSR-25F：CGCCGTCGTTAATGTTGTGTTT，SSR-25R：GCGCCAGTAGTCGATTGATTGA,

SSR-26F：CCTCAGGGGCATCTACGCTTAT，SSR-26R：GGAGCAGAAGGTGGCGGTTTTG，

SSR-37F：CGGAGACCAGGGGCACATACTT，SSR-37R：AGCAGCACTTTGGTAGGATGTC，

SSR-38F：GTTTGAAGAGCACGGCCAAGAA，SSR-38R：CATGGCGCAGGAGAACTACTA，

InDel-1F：CATGCAAAGGTGGAGGGAGT，InDel-1R：ACCTACCATCGTCAAGTTTTTGT，

InDel-2F：TGGGCCTATAGTGAATTGGGC，InDel-2R：TGCTAGATTGCTCTCTTGTGTGT，

InDel-3F：TGGACACAAAGCCAAGCGAC，InDel-3R：GTGGTGATGGCGTTGTCAGT，

InDel-4F：ACCACATTCACGAATCACGA，InDel-4R：TCGTCGTATTTTAGCCCTGACA。

2.根據權利要求1所述的分子標記，其特征在于，所述SSR引物和InDel引物大小為：SSR-10F：248bp，SSR-10R：250bp，SSR-25F：210bp，SSR-25R：190bp,SSR-26F：223bp，SSR-26R：198bp，SSR-37F：220bp，SSR-37R：196bp，SSR-38F：195bp，SSR-38R：220bp，InDel-1F：180bp，InDel-1R：180bp，InDel-2F：245bp，InDel-2R：245bp，InDel-3F：145bp，InDel-3R：145bp，InDel-4F：200bp，InDel-4R：250bp。

3.根據權利要求1所述的分子標記的開發方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：(1)通過Mutmap+將抗草甘磷基因cp4-epsps基因定位在甘藍型油菜A01染色體19.5-20.5Mb物理區間之內；(2)使用MISA軟件識別參考組Darmar-bzh A01染色體抗草甘磷基因候選區間19.5-20.5Mb微衛星和復合微衛星序列，使用設計軟件Primer3設計所述候選區間內SSR引物；(3)使用BWA和GATK對親本和抗感子代重測序數據預處理，通過IGV軟件可視化親本和抗感子代池A01染色體19.5-20.5Mb內InDel變異，IGV軟件鎖定此區間內InDel的起始和終止位置并設計InDel引物；(4)利用所述SSR引物和InDel引物進行PCR擴增得擴增產物。

4.根據權利要求3所述的開發方法，其特征在于，所述PCR擴增的反應體系為：10×PCRbuffer(含Mg2+)1.9μL,2.5mmol·L-1dNTPs 0.25μL,Taq酶(2.5U·μL-1)0.31μL,各待檢測單株的DNA 2.2μL,前/后引物各0.36μL,ddH2O補充至終體積為11μL。

5.根據權利要求4所述的開發方法，其特征在于，所述PCR擴增的程序為：94℃5min預變性，94℃30s變性，52℃—60℃30s退火,72℃30s，延伸，72℃5min延伸，共35個循環。

6.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，將所述擴增產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述聚丙烯酰胺凝膠為200mL 5×TBE，78g丙烯酰胺，2g甲叉丙烯酰胺，加入超純水定容至1L。