[發(fā)明專利]含有細胞的生物凝膠組合物、其制備方法及應用

在審

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• 申請日: 2020-05-18
• 公開（公告）號: CN111714698A
• 公開（公告）日: 2020-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 尹玉靜;饒義偉
• 申請（專利權(quán)）人: 北京奧泰康醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限公司;北京帝康醫(yī)藥投資管理有限公司
• 主分類號: A61L27/36
• 分類號: A61L27/36;A61L27/38;A61L27/50;A61L27/52
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 潘穎

1.含有細胞的生物凝膠組合物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1：取網(wǎng)膜經(jīng)清洗、脫細胞、消化后制得生物凝膠；

步驟2：取細胞接種至所述生物凝膠，制得含有細胞的生物凝膠組合物；

所述脫細胞包括化學脫細胞、生物脫細胞和/或物理脫細胞；所述化學脫細胞的試劑包括十二烷基硫酸鈉；所述生物脫細胞的試劑包括DNA酶；所述物理脫細胞包括震蕩；

所述消化包括生物消化和/或物理消化；所述生物消化的試劑包括消化酶溶液，所述物理消化包括攪拌。

2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟1中所述脫細胞采用含十二烷基硫酸鈉與DNA酶的緩沖液浸泡所述網(wǎng)膜，震蕩；

所述脫細胞包括第一脫細胞和第二脫細胞；

所述第一脫細胞的緩沖液中，十二烷基硫酸鈉的濃度為1.5～3.5％重量比、優(yōu)選1.5～2.5％重量比、更優(yōu)選1.8～2.2％重量比、最優(yōu)選2.0％重量比；DNA酶的濃度為3500～4500U/L、優(yōu)選3600～4400U/L、更優(yōu)選3800～4200U/L、最優(yōu)選4000U/L，pH為7.2～7.4；

所述第二脫細胞的緩沖液中，十二烷基硫酸鈉的濃度為0.6～1.5％重量比、優(yōu)選0.7～1.3％重量比、更優(yōu)選0.8～1.2％重量比、最優(yōu)選1.0％重量比；DNA酶的濃度為2500～3500U/L、優(yōu)選2600～3400U/L、更優(yōu)選2800～3200U/L、最優(yōu)選3000U/L，pH為7.2～7.4。

3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟1中所述脫細胞還包括第三脫細胞；

所述第三脫細胞的緩沖液中，十二烷基硫酸鈉的濃度為0.1～0.6％重量比、優(yōu)選0.2～0.6％重量比、更優(yōu)選0.4～0.6％重量比、最優(yōu)選0.5％重量比；DNA酶的濃度為1500～2500U/L、優(yōu)選1600～2400U/L、更優(yōu)選1800～2200U/L、最優(yōu)選2000U/L，pH為7.2～7.4；

所述脫細胞的時間為4～12h，所述脫細胞的震蕩頻率為100～200r/min。

4.如權(quán)利要求1至3任一項所述的制備方法，其特征在于，步驟1中所述清洗采用磷酸鹽緩沖液；所述消化為：取脫細胞后的網(wǎng)膜基質(zhì)與消化液混合，攪拌，終止消化；以g/mL計，脫細胞后的網(wǎng)膜基質(zhì)與消化液的重量體積比為(10～20)：100；

所述消化液包括胰酶、膠原酶、dispaseII和PBS溶液；

其中，胰酶、膠原酶、dispaseII的質(zhì)量比為2：2：(1～2)；

胰酶的酶活為6000～8000BAEE units/mg；膠原酶的酶活為125～150CDU/mg；dispaseII的酶活為10～20units/mg；

胰酶、膠原酶與dispaseII在PBS溶液的濃度分別為0.05～0.25％，pH為7.2～7.4。

5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述攪拌的轉(zhuǎn)速為60～100rpm，所述消化為于37℃，5％CO₂消化30～45min；所述終止消化采用血清，血清與消化液的體積比為(1～2)：10。

6.如權(quán)利要求1至5任一項所述的制備方法，其特征在于，所述脫細胞之前還包括脫脂的步驟；所述脫脂包括化學脫脂和/或物理脫脂；所述化學脫脂采用體積比為1：1：(0.2～1)、優(yōu)選1：1：(0.4～0.7)、更優(yōu)選1：1：0.5的甲醇、氯仿和乙醚的混合溶液進行，所述化學脫脂的時間為18～30h；所述物理脫脂采用震蕩的方法；所述震蕩的頻率為150～250r/min。

7.如權(quán)利要求1至6任一項所述的制備方法，其特征在于，步驟1中所述制得生物凝膠為調(diào)整濃度為10～20mg/mL，于37℃5～10min，即得所述生物凝膠；

步驟2中細胞的接種密度為5×10⁶～5×10⁷個/mL。