[發明專利]用于產生睫狀邊緣帶樣結構的方法

在審

• 申請號: 202010418301.1
• 申請日: 2013-06-07
• 公開（公告）號: CN111607557A
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發明（設計）人: 中野德重;安藤覺;笹井芳樹;永樂元次
• 申請（專利權）人: 住友化學株式會社;國立研究開發法人理化學研究所
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李唐

1.用于產生包含睫狀邊緣帶樣結構、視網膜色素上皮和神經視網膜的細胞聚集體的方法，其包括以下步驟：在含有增強Wnt信號途徑的物質的無血清培養基中，將從多能干細胞制備的且形成這樣的視網膜組織的細胞聚集體僅在出現表達RPE65基因的細胞之前培養一段時間，在所述視網膜組織中Chx10陽性細胞以所述組織的20%或更高的比例存在，隨后在各自不含有增強Wnt信號途徑的物質的含血清替代物的無血清培養基或含血清培養基中培養因此獲得的其中不出現表達RPE65基因的細胞且CHx10陽性細胞以降低的比例存在于視網膜組織中的細胞聚集體，由此獲得包含睫狀邊緣帶樣結構、視網膜色素上皮和神經視網膜的細胞聚集體，其中所述視網膜色素上皮和神經視網膜鄰近于所述睫狀邊緣帶樣結構存在，并且

其中所述形成其中Chx10陽性細胞以所述組織的20%或更高的比例存在的視網膜組織的細胞聚集體是可以通過包括以下步驟（1）至（3）的方法制備的細胞聚集體：

（1）第一步，使多能干細胞在含有抑制Wnt信號途徑的物質的無血清培養基中進行懸浮培養，以形成多能干細胞的聚集體，

（2）第二步，使在第一步中形成的聚集體在含有基膜制劑的無血清培養基中進行懸浮培養，和

（3）第三步，使在第二步中培養的聚集體在含血清培養基中進行懸浮培養。

2.權利要求1的產生方法，其中出現表達RPE65基因的細胞之前的一段時間是這樣的一段時間，在所述時間內Chx10陽性細胞以組織的50%-1%之內的比例存在，并且其中不出現表達RPE65基因的細胞且CHx10陽性細胞以降低的比例存在于視網膜組織中的細胞聚集體是其中Chx10陽性細胞以組織的50%-1%之內的比例存在于視網膜組織中的細胞聚集體。

3.權利要求2的產生方法，其中在各自不含有作用于Wnt信號途徑的物質的無血清培養基或含血清培養基中培養因此獲得的其中不出現表達RPE65基因的細胞且CHx10陽性細胞以降低的比例存在于視網膜組織中的細胞聚集體，直至視網膜組織中存在的Chx10陽性細胞的比例達到所述組織的50%或更高。

4.權利要求1-3中任一項的產生方法，其中所述視網膜組織來源于人多能干細胞。

5.通過權利要求1-4中任一項的產生方法產生的包含睫狀邊緣帶樣結構、視網膜色素上皮和神經視網膜的細胞聚集體。

6.包含睫狀邊緣帶樣結構、視網膜色素上皮和神經視網膜的細胞聚集體，其中所述視網膜色素上皮和神經視網膜鄰近于所述聚集體中的睫狀邊緣帶樣結構存在。

7.權利要求5或6的細胞聚集體，其中所述神經視網膜在所述細胞聚集體的表面上。

8.權利要求5-7中任一項的細胞聚集體，其中所述神經視網膜是連續的分層神經視網膜。

9.權利要求5-8中任一項的細胞聚集體，其中所述神經視網膜在不少于10%的所述細胞聚集體周圍中存在。

10.權利要求5-9中任一項的細胞聚集體，其中所述神經視網膜不被視網膜色素上皮覆蓋。

11.權利要求5-10中任一項的細胞聚集體，其中所述神經視網膜包含層特異性Crx陽性細胞。

12.產生神經視網膜的方法，其包括從權利要求5-11中任一項的細胞聚集體中切出神經視網膜，由此獲得純化的神經視網膜。