[發(fā)明專利]一種桉樹組培外植體制備及無菌芽誘導方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010417734.5
• 申請日: 2020-05-18
• 公開（公告）號: CN111406650B
• 公開（公告）日: 2022-09-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄧紫宇;劉媛;盧翠香;任世奇;郭東強;唐慶蘭;陳升侃;伍琪;李昌榮;周維;陳健波;甘春雁
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學研究院
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;C05G3/60;C05G5/20
• 代理公司: 南寧深之意專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 45123
• 代理人: 盧穎

1.一種桉樹組培外植體制備及無菌芽誘導的方法，其特征在于：包括優(yōu)樹選擇，環(huán)割促萌，水培促萌，外植體處理和誘導培養(yǎng)工序，選擇桉樹優(yōu)樹，在離地面20-25cm處進行環(huán)割促萌，待萌芽條生長至直徑2-3cm時，剪取60cm長、完全木質(zhì)化且?guī)摲康闹l在培養(yǎng)室中進行水培，待潛伏芽萌發(fā)并生長至3-4cm時，剪取莖段作為外植體并進行消毒后，接種于誘導培養(yǎng)基中，置于適宜的環(huán)境中進行誘導培養(yǎng)，最后獲得生長健壯、活力旺盛的桉樹無菌芽；主要的操作步驟如下：

（1）優(yōu)樹選擇

選擇樣地內(nèi)樹高、胸徑、單株材積等生長指標前5%，且無病蟲害、干形通直、分枝小的桉樹個體為優(yōu)樹；

（2）環(huán)割促萌

鏟除優(yōu)樹周圍雜灌，環(huán)割前一天于優(yōu)樹周圍噴曬75%酒精進行消毒，在優(yōu)樹離地面20-25cm處進行環(huán)割樹周長的3/4，環(huán)割寬度2 cm，剝皮并刮盡形成層至韌皮部；

（3）水培促萌

待萌芽條生長至直徑2-3cm時，剪取60cm長、完全木質(zhì)化且?guī)摲康闹l，去除葉片，帶回培養(yǎng)室進行水培，每4天噴灑一次體積濃度2%的綠茶提取物抑菌；

（4）外植體處理

待潛伏芽萌發(fā)并生長至3-4cm時，剪取2-3cm莖段作為外植體，將外植體用75%酒精浸泡15s，無菌水清洗2-3次，然后用2%次氯酸鈉浸泡1min，最后用無菌水清洗2-3次，用濾紙吸干，備用；

（5）誘導培養(yǎng)

將步驟（4）處理好的外植體接種到誘導培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng)，暗培養(yǎng)7d后，在溫度25±2℃，光照12h/d，光照強度1500-2000lux條件下培養(yǎng)20-25d，獲得生長健壯、活力旺盛的桉樹無菌芽；

步驟（3）所述的水培的培養(yǎng)基包括以下組分：每1L培養(yǎng)基中含50mg綠茶提取物，2.5mg核黃素（VB₂），其余為純水；

步驟（5）所述的誘導培養(yǎng)基為：改良MS培養(yǎng)基+5-10mg/L 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）+2.4mg/L D-泛酸鈣（VB₅）+0.24mg/L生物素（VH）+2.5mg/L L-半胱氨酸；

所述的改良MS培養(yǎng)基的組成為：1800mg/L KNO₃、360mg/L NH₄NO₃、270mg/L KH₂PO₄、200mg/L CaCl₂、360mg/L MgSO₄、10mg/L H₃BO₃、25 mg/L MnSO₄、10 mg/L ZnSO₄、0.25 mg/LNa₂MoO₄、0.025 mg/L CuSO₄、0.025 mg/L CoCl₂、0.83 mg/L KI、1000mg/L PVP、2.4mg/L D-泛酸鈣（VB₅）、0.24mg/L生物素（VH）、100mg/L L-半胱氨酸、2mg/L甘氨酸、5mg/L煙酸（VB₃）、2mg/L硫胺素（VB1）、0.5mg/L吡哆素（VB₆）、37.3mg/L Na₂-EDTA、27.8mg/L FeSO₄、100mg/L肌醇、0.4mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、30g/L蔗糖、6g/L瓊脂粉，pH 值5.8~6.2；

所述的綠茶提取物的制備方法是：將綠茶粉末加入乙醇—水溶液，于50-55℃恒溫水浴條件下進行2-3次超聲波提取，得到混合液，再將混合液進行微波提取，過濾，得到綠茶提取液；

其中，所述的綠茶粉末與乙醇—水溶液的料液比為：1： 20-40g/mL；

所述乙醇-水溶液中乙醇的體積分數(shù)為70％-90％；

所述的超聲時間為10-60min；超聲功率為200-500w；

所述的微波功率為160-480w；微波時間為30-60s。