[發明專利]一種用于增強siRNA遞送的多功能脂質體的制備方法

在審

• 申請號: 202010417105.2
• 申請日: 2020-05-18
• 公開（公告）號: CN111450261A
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發明（設計）人: 謝晶;趙雅蓉;張歡;畢野
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: A61K47/69
• 分類號: A61K47/69;A61K47/64;A61K31/7088;A61K47/42;A61P35/00
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

本發明提供一種用于增強siRNA遞送的多功能脂質體的制備方法，采用固相肽合成的方法，利用酰胺鍵將R8與不同疏水性的脂肪酸進行共價連接，制成三種兩親性的穿膜肽；采用多聚陽離子魚精蛋白將siRNA壓縮，保護了siRNA免受核酸酶的降解，提高siRNA的包封率；然后通過乙醇稀釋法將內核包裹進入脂質體中間層，中間層的改性穿膜肽能夠幫助脂質體穿過細胞膜，而條件性電離的陽離子磷脂能夠幫助內涵體逃逸；最后對脂質體進行轉鐵蛋白和聚乙二醇的修飾，使脂質體能夠靶向腫瘤的同時延長在血液中的循環時間。這種新型的多功能脂質體綜合了各種載體系統所具有的優點，能夠在體內遞送siRNA到達腫瘤部位，發揮高效的RNA干擾作用。

技術領域

本發明公開一種用于增強siRNA遞送的多功能脂質體的制備方法，為一種多功能脂質體，屬于醫藥生產技術領域。

背景技術

隨著siRNA研究的興起, 以特定的基因作為靶位的治療策略成了國際制藥領域的一大研究和開發的熱點。在實際應用過程中，基因治療存在的最大障礙是缺少安全、高效的載體系統。目前所采用的載體主要分為兩大類，即病毒載體和非病毒載體。病毒載體因具有轉導效率及表達效率高的特點而得到廣泛應用,但其本身存在不可避免的安全性問題，如表達外源基因時間短，免疫原性強，易引發強烈的炎癥反應和免疫反應，毒性較大等。相比之下，非病毒載體具有安全性好、重復性高、制備簡單等多項優點。脂質體作為常用的非病毒性載體容易制備、安全性高，卻難達到質控要求，體內基因導入效率低，且無靶向性，使得其應用受到限制。因此，提供一種安全性高，具有靶向性，轉染效率好的脂質體是本發明要完成的任務。

細胞穿膜肽是一類能夠攜帶大分子物質進入細胞的短肽，可用于提高體內基因載體的遞送效率，例如八聚精氨酸（R8）。然而由于 R8 極性較強，自身的穿膜效果并不理想。因此對R8進行脂肪酸修飾，能夠使其具有兩親性。此外，將改性穿膜肽與靶向配體聯合應用，既能克服改性穿膜肽特異性差的缺點，又能改善靶向配體穿膜效率低的不足，有效地提高 siRNA 進入細胞的效率。

常規的脂質體采用的磷脂，膽固醇作為脂相來制備。當用于遞送siRNA時，選擇陽離子磷脂，如DODMA，DOTMA和DOTAP等。聚乙二醇的加入能夠延長脂質體在血液中的循環時間。為了增強脂質體對細胞的靶向性和穿透能力，使用改性細胞穿膜肽和腫瘤特異性配體轉鐵蛋白共同修飾脂質體，以達到目的。

發明內容

本發明提供一種用于增強siRNA遞送的多功能脂質體的制備方法，采用固相肽合成的方法，利用酰胺鍵將R8與不同疏水性的脂肪酸進行共價連接，包括油酸（OA）亞油酸（LA）和硬脂酸（StA），制成三種兩親性的穿膜肽（OA-R8, LA-R8, StA-R8）。

本發明利用改性穿膜肽和靶向配體制備一種多功能脂質體，細胞毒性低，對siRNA的轉染效率高，靶向性強。

本發明進一步提供了一種多功能脂質體的制備工藝，粒徑低于200nm，粒度均一，分散性好，呈正電性。

本發明提供一種多功能脂質體，將魚精蛋白結合siRNA包裹在核心防止其降解，其特征在于由改性穿膜肽與腫瘤細胞特異性配體轉鐵蛋白共修飾，是一種新型的基因傳遞系統。

本發明所述的一種多功能脂質體制備方法，包括以下步驟：

1、采用乙醇稀釋法制備多功能脂質體。將卵磷脂和膽固醇作為輔助脂質摻入脂質體中，并使用陽離子脂質與改性穿膜肽混合制備脂質體。制備處方為陽離子磷脂20%~30%，改性穿膜肽15%~25%，卵磷脂 18%，膽固醇 35%，聚乙二醇2%，在乙醇中溶解后按照比例混合均勻后，采用透析法除去乙醇，透析液為pH 7.2~7.4緩沖液，室溫透析2~3小時后，取出脂質體。在馬爾文激光粒度分析儀上測定粒徑和Zeta電位。