[發(fā)明專利]一種水中阿米巴孢子的快速計數(shù)方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010414898.2
• 申請日: 2020-05-15
• 公開（公告）號: CN111549093A
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 金超;趙令銨;王璐婷;舒龍飛
• 申請（專利權(quán)）人: 中山大學
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06;G01N21/31
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務(wù)所 23109
• 代理人: 岳泉清

一種水中阿米巴孢子的快速計數(shù)方法及其應(yīng)用，本發(fā)明涉及微生物的檢測方法領(lǐng)域。本發(fā)明要解決現(xiàn)有阿米巴孢子計數(shù)方法存在操作復(fù)雜，效率低的技術(shù)問題。方法：制備多種濃度的阿米巴孢子液；對各濃度阿米巴孢子液進行精確計數(shù)測量，獲得各濃度阿米巴孢子液中阿米巴孢子量；測定各濃度阿米巴孢子液吸光度；通過建立標準曲線，獲得線性回歸方程；稀釋待測樣品；測定稀釋阿米巴孢子液的吸光度；利用線性回歸方程計算稀釋阿米巴孢子液中的阿米巴孢子量。本發(fā)明方法設(shè)計巧妙，方便快速，準確性高，結(jié)果可靠，成本低，應(yīng)用廣泛，具有良好的實用性和廣泛性。本發(fā)明用于快速測量水中阿米巴孢子計數(shù)及阿米巴孢子相關(guān)檢測中。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物的檢測方法領(lǐng)域。

背景技術(shù)

阿米巴(amoebas)是原生生物六大類群之一，分布十分廣泛，是土壤中主要的原生動物，在土壤的物質(zhì)循環(huán)、能量轉(zhuǎn)化、細菌群落調(diào)控、碳氮元素礦化、植物促生等方面都發(fā)揮了關(guān)鍵作用。研究表明，阿米巴與細菌有著復(fù)雜的互作關(guān)系：它捕食細菌，也會被致病菌感染，還能和細菌形成穩(wěn)定的共生關(guān)系。阿米巴利用孢子進行繁殖，其孢子具有遷移能力強、抗熱抗氧化等特性。一旦阿米巴被致病菌感染，產(chǎn)出的孢子經(jīng)過土壤進入水體，進一步污染地下水、江河湖泊地表水、飲用水，將嚴重危害生態(tài)安全和人體健康。臨床上，溶組織內(nèi)阿米巴引發(fā)的病例多，感染面廣，危害大。

對水中阿米巴孢子的定量監(jiān)測和準確計數(shù)，是防控污染、保護飲用水源安全和人體健康的重要措施。現(xiàn)有的孢子計數(shù)方法有平板菌落計數(shù)法、血球計數(shù)板計數(shù)法、流式細胞儀計數(shù)法等。

傳統(tǒng)的平板菌落計數(shù)法需要將待測樣品充分稀釋，其中的微生物充分分散成單個細胞，然而待測樣品往往不宜完全分散成單個細胞，阿米巴繁殖速度很快，影響孢子量測定，難以獲得精確的結(jié)果。

血球計數(shù)板計數(shù)法需要利用血球計數(shù)板和顯微鏡進行逐點計數(shù)，在樣品濃度較高時容易出現(xiàn)重復(fù)計數(shù)或漏數(shù)的情況，存在人工操作繁瑣、工作量大、耗時長、效率低、準確度欠缺等問題。

使用流式細胞儀、庫爾特計數(shù)儀等儀器進行計數(shù)成本較高，同時阿米巴孢子容易沉淀，堵塞管道，雖然計數(shù)快速準確，但是不利于廣泛推廣使用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決現(xiàn)有阿米巴孢子計數(shù)方法存在操作復(fù)雜，效率低的技術(shù)問題，而提供一種水中阿米巴孢子的快速計數(shù)方法及其應(yīng)用。

一種水中阿米巴孢子的快速計數(shù)方法，按以下步驟進行：

一、挑取含有阿米巴孢子的培養(yǎng)基，然后采用磷酸鹽緩沖液進行稀釋，分別稀釋1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍，獲得不同濃度的阿米巴孢子液；

二、采用血球計數(shù)板計數(shù)法，將步驟一獲得各濃度阿米巴孢子液進行精確計數(shù)測量，每種濃度重復(fù)測量3～5次，計算平均值即為各濃度阿米巴孢子液中阿米巴孢子量C；

三、采用紫外可見分光光度計分別測定步驟一獲得各濃度阿米巴孢子液吸光度A；測定波長為250nm～265nm；

四、以步驟二獲得的各濃度阿米巴孢子液中孢子量C為橫坐標，以步驟三獲得的各濃度阿米巴孢子液的吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線，獲得線性回歸方程y＝ax+b，其中y為不同濃度阿米巴孢子液的吸光度A，x為不同濃度的阿米巴孢子液中孢子量C，單位為個/mL，并根據(jù)步驟二和步驟三中已測得的數(shù)據(jù)，計算得出a和b的值；

五、將含阿米巴孢子的待測樣品稀釋，獲得稀釋阿米巴孢子液；

六、采用紫外可見分光光度計測定步驟五獲得的稀釋阿米巴孢子液的吸光度；

七、通過步驟六獲得的吸光度，利用步驟四獲得的線性回歸方程計算步驟五獲得的稀釋阿米巴孢子液中的阿米巴孢子量。